第二章植物组织培养的基本原理

1、 讲授内容讲授内容n 1.1 细胞的全能性细胞的全能性n 1.2植物细胞分化与脱分化植物细胞分化与脱分化n 1.3植物的形态建成植物的形态建成n 1.4基因表达与位置效应及器官分基因表达与位置效应及器官分 化信息传递化信息传递第二章第二章 植物组织培养的基本原理植物组织培养的基本原理植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 （Haberlandt, 1902）1.1 植物细胞全能性1、细胞全能性（cell totipotency) ：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物

2、种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。植物组织培养的理论基础细胞全能性细胞全能性（红萝卜）1.1.分化分化differentiationdifferentiation： 细胞细胞在分裂过程中发生结构和功能上的在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。组织和器官完成整个生活周期。1.2 植物细胞的分化与脱分化植物细胞的分化与脱分化高等植物细胞分化示意图高等植物细胞分化示意图幼年细胞细胞分裂细胞分裂多细胞团形态建成完整植株细胞分化细胞分化2.脱分化dedifferentiation: 已分化好的细胞

3、在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。3.再分化redifferentiation: 脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。1.2 植物细胞的分化与脱分化植物细胞的分化与脱分化离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽再再生生植植株株植物组织培养过程植物组织培养过程（高等植物细胞脱分化和在分化示意图）（高等植物细胞脱分化和在分化示意图）1.3 植物的形态建成植物的形态建成1.3 植物的形态建成植物的形态建成细胞培养再生细胞培养再生完整的植株完整的植株茎芽分化（器官分化）茎

4、芽分化（器官分化）体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生外植体的成苗途径外植体的成苗途径试管苗试管苗外植体外植体愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽芽芽根根根根 芽芽体细胞胚体细胞胚试管苗试管苗体细胞胚体细胞胚试管苗试管苗1.3.1愈伤组织的诱导与器官分化一、基本概念脱分化 ： 具有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下具有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，细胞改变原来的分化状态，失去原有的结构与功能，转，细胞改变原来的分化状态，失去原有的结构与功能，转变为具有分生能力的细胞的过程变为具有分生能力的细胞的过程 。愈伤组织： 植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经脱分植物各种器官的外植体在离体的条件下，

5、细胞经脱分化等一系列过程，转变为分生细胞，进而转变形成一种能化等一系列过程，转变为分生细胞，进而转变形成一种能够迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团够迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团 一般低，植物各器官、组织都有被诱发产生愈伤组织的潜在可能性。 自然条件下的植物愈伤组织刺桐刺桐树树1.3.1愈伤组织的诱导与器官分化愈伤组织的诱导与器官分化一）、愈伤组织的诱导 诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。1、 常用激素与浓度激素类型 激素浓度生长素类（2，4-D, IAA , NAA) 0.0110 mg/L细胞分裂素类（玉米素，6-BA ) 0.1

6、10 mg /L1）、激素： 多数情况下，单独使用2，4-D可以成功诱导愈伤组织的发生案例1：MS培养基含有不同浓度2，4-D时斑茅幼叶形成愈伤组织的诱导率（%） 不同浓度的2，4-D对愈伤组织的诱导率是不同的。一般情况下，2，4-D的浓度过低（低于10-9mg/L）时，愈伤组织生长缓慢；浓度过高（高于10 mg/L）时，就会抑制愈伤组织的生长。2、影响愈伤组织诱导的因素：、影响愈伤组织诱导的因素：二、愈伤组织的形成愈伤组织从增殖的组织细胞中产生，激素改变细胞的新陈代谢状态，从生长静止期到代谢旺盛。v从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：起动期 （诱导期）、分裂期和分化期。v三个时期愈

7、伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。 （1）诱导期诱导期（起动期（起动期、或起始期、或起始期）: : v起动期： 细胞准备分裂的时期，愈伤组织形成起点。 外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞。 在外源植物激素的作用下，处于静止状态的植物细胞经过复杂的脱分化过程恢复分裂能力转化为分生细胞。此过程有人称之为：细胞的诱导活化过程。 期，并发生同步分裂。期，并发生同步分裂。v在诱导期，代谢活化了，细胞内的合成代谢加强，如合成代谢加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。但是细胞的大小仍然和外植体时一样，

8、没有多大改变。诱导期的长短v由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素决定。 例如：菊芋的诱导期有时还不需要1天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从11月到次年4月取菊芋块茎进行培养，则诱导期从22小时逐渐延长到40小时。 外植体外植体(explant)中中已分已分化的活细胞在外源激素化的活细胞在外源激素的作的作用下，外植体用下，外植体外层细胞外层细胞出现出现了分裂，由于外层细胞的了分裂，由于外层细胞的迅迅速分裂速分裂使得这些细胞的使得这些细胞的体积体积缩小，缩小，逐渐回复到逐渐回复到分生组织分生组织状态，状态，该时期细胞通过该时期细胞通过脱

9、分脱分化化的起动期而进入的起动期而进入分裂，分裂，并并开始开始形成愈伤组织。形成愈伤组织。（2）分裂期：分裂期分裂期特征： 生理生化上分裂期的一个明显特征是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大，RNA含量达到最高等。 此时期的愈伤组织：细胞分裂快，结构疏散，缺此时期的愈伤组织：细胞分裂快，结构疏散，缺少组织的结构，颜色浅而透明。少组织的结构，颜色浅而透明。 分裂期愈伤组织分裂期愈伤组织v 细胞分裂从分裂期的周缘细胞分裂为主逐渐转向内部的组织细胞，愈伤组织表层细胞分裂减缓或停止，内部深层细胞分裂并形成像维管束或类似于分生组织组成的鸟巢状结构的

10、次生组织。v 此时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小趋于稳定。（3）形成期（形成期）： 生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。形成期愈伤组织的特点：形成期愈伤组织的特点： 根据形态变化列出三个时期，实际上它们的界限并不分严格，特别是分裂期和分化期。一块培养组织的细胞既有分裂的又有分化的。v 不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈淡黄色或白色，有的愈伤组织呈绿色或红色。 v 一般来说，来源于相同组织的愈伤组织含有的色素大致相同， 但经过反复继代培养后会失去色素。 愈伤组织的类型：

11、愈伤组织的类型：根尖愈伤组织根尖愈伤组织 （无色透明）（无色透明）茎尖愈伤组织茎尖愈伤组织 （淡绿色）（淡绿色）植物愈伤组织类型举例：植物愈伤组织类型举例：当归茎段愈伤组织（绿色） 香茶菜愈伤组织香茶菜愈伤组织 锁阳愈伤组织（红色）锁阳愈伤组织（红色）1.3.1.2 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生v愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整小植株。v 愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式主要有三种：1)、先产生芽，后在茎的基部长根；2)先长根，再长芽；3)愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。 一）、一）、 愈伤组织形

12、成愈伤组织形成1 、器官的形成 一般愈伤组织开始分化时，由大小不等的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞，保持相对稳定状态。 在分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成分生中心。芽多发生在愈伤组织的表层，属外起源。二）、激素对愈伤组织分化的影响v植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA的浓度是NAA的50100倍时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6-BA浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔球形成。愈伤分化愈伤分化不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响器官分化的植物激素控制理论v大量的实验结果表明：

13、大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。 即：生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(1,2-D)高高(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)低低(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)器官发生途径器官发生途径木本植物愈伤组织形态发生的人为调控v第一步：利用分化培养基（含有6-BA、CPPU、KT）使愈伤组织形成不定芽，增加繁殖系数。v 第二步：当不定芽长大出现叶片后，再将伸长的苗从基部切下转入含生长素类（如IAA、NAA

14、）的生根培养基上培养诱导根的生成。 四四 、 愈伤组织的培养愈伤组织的培养一）、培养基一）、培养基 培养基培养基一般包括一般包括大量大量元素、元素、微量微量元素和一种元素和一种碳水碳水化合物化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。，最常用的碳水化合物是蔗糖。 这样简单的培养基这样简单的培养基(基本培养基基本培养基)只有很少几种植只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物（加各种各样的附加物（完全培养基），完全培养基），如维生素如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如

15、、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物如椰子、各种营养性的提取物如椰子汁等。汁等。注意：注意： 选用完全已知的合成化合物，不大主张选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。椰子汁等。必须强调：必须强调： 适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维持这些愈伤组织；适合于液体培养的合于维持这些愈伤组织；适合于液体培养的培养基也不一定适合于固体培养。培养基也不一定适合于固体培养。 培养基中的培养基中的N，大多数都用，大多数都用硝态氮硝态氮，只有，只有MS培养培养基和基和B5培养基中才用培养基中才用硝态和铵态硝态和铵态的混合物。的混合物。 K的水平在近代的培养基中有逐渐的水平在近代的培养基中有逐渐提高提高的趋势。的趋势。 实验表明：各种离子浓度大为不同的培养基往往能实验表明：各种离子浓度大为不同的培养基往往能使相同的组织快速生长。使相同的组织快速生长。 例如例如Hildebrandt培养基与培养基与MS培养基显著不同，但培养基显著不同，但二者都能培养烟草的愈伤组织。二者都能培养烟草的愈伤组织。二）、愈伤的培养方式：1、按培养基的物理状态，愈伤组织培 养分为固体和液体培养两大类。