地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立

1、地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立         08-07-03 16:29:00     作者：尹德明，温学森，娄红    编辑：studa0714【摘要】  目的 探计对地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养的条件。方法 用MSK2和MS培养基对地钱配子体进行愈伤组织诱导，运用模糊评判对MSK2培养基生长激素组合进行综合性状评价。结果 MSK2和MS（2?mg/L 6BA）均能诱导出地钱愈伤组织，其中MSK2的诱导效果

2、较好。光照（3?0008?000 lux）能有效地促进地钱愈伤组织生长。激素配比组合是0.5?mg/L 2,4D+2?mg/L NAA+2?mg/L 6BA适合于地钱细胞生长以及次生代谢生产。 结论 地钱愈伤组织的诱导成功和悬浮细胞培养条件的建立，为探索药用苔藓植物次生代谢产物生产提供新的途径以及对苔藓植物细胞规模化培养提供新的理论指导。 【关键词】  苔藓；地钱；愈伤组织；植物细胞培养To induce callus tissues and establish suspension culture of Marchantia polymorpha L. Methods 

3、MSK2 and MS mediums were used to induce gametophytes into callus tissues, and the fuzzy comprehensive evaluation method was used to assess the optimal phytohormone combination. Results  Both MSK2 and MS (2?mg/L 6BA) mediums  could induce callus tissue formation, and the MSK2 medium was sup

4、erior to the MS medium for callus tissue induction. Light intensity（3?0008?000 lux） effectively promoted the callus tissue growth. Optimal phytohormone combination for cell growth and secondary metabolism production was 0.5?mg/L 2, 4D+2?mg/L NAA+2?mg/L 6BA. Conclusions  Successful induction of

5、the callus tissues and establishment of suspension culture of Marchantia polymorpha L. provide a new pathway for exploring the pharmaceutical moss to produce secondary metabolism and new theory guidance  for suspension culture of moss cells on a large scale.Key words: Bryophyte; Marchantia poly

6、morpha L.; Callus tissue; Cell culture 1  材料与方法1.1  实验材料1.1.1  无菌材料获得及愈伤组织诱导 实验所用的地钱（Marchantia  polymorpha L.）配子体由本实验室提供。将培养在温室内地钱上的湿沙洗掉，流水冲洗2?h，在无菌室内用无菌滤纸吸干，剪成0.5?cm块状，放入7% NaClO消毒2?min，无菌水冲洗3次，于培养温度为25?，光照时间12?h/d，光强为5?000?lux的条件下。采用MS、MS（2?mg/L 6BA）和MSK27作为愈伤组织诱导培养基。以上培养基均添加0

7、.9%琼脂，在高温灭菌前pH值调至5.8。1.1.2  悬浮培养条件的建立 悬浮细胞经液体培养基继代培养5代以上，作为细胞种子。选取MSK2、MS、KNOP、White、B5、Miller、1/2MSK2和1/2MS等用于筛选悬浮细胞培养基，将筛选得到对细胞生长良好培养基进行激素2,4D、NAA和 6BA（浓度0.5、1和2?mg/L）组合优化，以求建立对细胞生长和次生代谢合成均为有利的悬浮培养条件。第20?d取样进行各生化指标测定，重复3次。1.2  实验方法1.2.1  光照强度的设定 将固体培养愈伤细胞置于培养温度25?，光照时间12?h/d HPG350H

8、X智能型植物生长培养箱（黑龙江哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）内，分别设定光照强度0、3?000、5?000和8?000 lux来考察光照对细胞生长的影响。1.2.2  pH的测定 采用PHS2型精密酸度计(上海雷磁仪表厂)测定。1.2.3  叶绿素(chlorophyll)含量的测定 采用丙酮乙醇混合液法测叶绿素含量8。将10?mL悬浮地钱细胞经3?000?r/min离心后，置于6?mL丙酮和无水乙醇等比例混合浸提液中，放于暗处，室温下进行浸提，652?nm处测定光密度，叶绿素含量用mg/g或mg/L?表示。1.2.4  细胞膜通透性的测定 采用伊文思蓝（Ev

9、ans blue）染色法9。取1?g鲜细胞，用0.5?mL 0.05%的伊文斯兰溶液将细胞染色5?min后，PBS洗3次,以除去剩余染料，然后用含1% SDS（w/v）的50%（v/v）甲醇于50?下水浴30?min，以抽提蓝色染料，在600?nm?下测定吸光值。1.2.5  酚类积累的测定 取2?mL培养基滤液，加入10?mL乙酸乙酯，超声振荡后静止萃取2?h，取5?mL乙酸乙酯组分自然风干后，残留物溶于3?mL 75% 乙醇中，在280?nm下测量其吸光度，以3?mL 75% 乙醇为对照，以水杨酸为标准，以1?g水杨酸在280?nm处的吸光度代表一个单位的酚积累10。1.2.6&

10、#160; 生化指标综合评价 采用模糊隶属法用多项指标对激素配比组合进行综合评价：其中：U=U1，U2Un为评价因素集，Rij(i=1，2m；j=1，2n)为评价值，i为处理，j代表各生物学性状。将各测得到的数据按公式Rij=(Rij-Rjmin)/(Rjmax-Rjmin)处理，Rjmin指J性状中最小值；Rjmax指J性状中最大值，得到评判模糊矩阵R。按照各性状的重要性确立各因素的权重，得权重分配集A，使权重满足归一化要求ni=1Wi=1，通过矩阵运算 B= R·AT。1.3  统计学处理所有数据均以±s表示，应用SAS统计学软件进行方差分析，采用t检验进行显

11、著性检验，以P0.05为差异有统计学意义。2  结  果2.1  地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养 见图1。由图1可见。MSK2培养基第15?d就可见在地钱配子体周围已有深绿色愈伤组织产生，愈伤组织呈凝聚状，不断增多，并向培养基四周扩展及培养基内渗入，配子体不断缩小而愈伤组织愈来愈多。同样，培养在MS（2?mg/L 6BA）中的地钱配子体周围也产生浅绿色的愈伤组织，只是其配子体缩小缓慢，愈伤细胞生物量没有MSK2培养基多。而在MS培养基的配子体第20?d仍未见愈伤组织的产生。2.2  光强对地钱愈伤组织生长的影响 见表1。由表1可见，在光照3?000、5

12、?000和8?000?lux条件下，地钱愈伤细胞生物量显著高于未光照条件下地钱愈伤细胞生物量（n=3, P0.05）。2.3  不同培养基对地钱悬浮细胞生长和叶绿素含量的影响  见表2。由表2可见，KNOP培养基细胞生物量最高，其次是MSK2，次之是MS培养基，而Miller等培养基的细胞生物量则要显著低于上述3种培养基（n=3, P0.05）。其中稀释培养基1/2MSK2和1/2MS培养基的细胞生物量则分别低于MSK2和MS培养基（n=3, P0.01）。    MSK2培养基生物量高于除KNOP外的其他培养基，其叶绿素含量3.93?g/L高于KNOP、Miller和MS等培养基（n=3, P0.05）。另外，MSK2培养基诱导愈伤组织的效果比MS（2?mg/L 6BA）培养基要好（图1），因此本研究在MSK2培养基基础上，对其激素2,4D、NAA和 6BA进行不同比例组合优化，以求建立对细胞生长和次生代谢生产都较为有利的培养条件。2.4  不同激素组合对地钱细胞生长及次生代谢的影响 见表3。由表3可见，表中序号1和3细胞生物量高于序号10 MSK2（n=3, P0.05），序号6、7、8和9要低于序号10（n=3, P0.05），而序号2、4和5细胞生物量与序号10没有区别。同样，对于叶绿素含