主动脉环体外微血管生成模型的发展

1、主动脉环体外微血管生成模型的发展         08-07-15 11:03:00     作者：赵静 苗俊英    编辑：studa20           【关键词】动脉环微血管生成模型    在机体内只要有器官发生就有血管形成，主要包括血管新生（vasculogenesis）和血管生成（angioge

2、nesis），这对于氧、营养素、代谢产物的输送是必需的1。血管新生仅发生在胚胎早期，血管生成常见于某些病理情况，如伤口愈合、肿瘤等2。大量的研究不断证明，血管生成在肿瘤发生、发展、浸润、转移等生物学过程发挥重要作用。为了进一步研究肿瘤血管生成及其调控机制，分析血管生成促进因子或抑制因子活性和作用的检测，验证针对血管生成进行的肿瘤治疗措施等，必须建立肿瘤血管生成的研究模型3。本文对肿瘤血管生成的优秀模型，主动脉环模型的发展进行综述。    1  动脉环模型发展简史    动脉环血管生成模型由Nicosia于1984年首次报道4

3、。当时采用血浆凝块包埋大鼠主动脉环，发现大鼠动脉环产生微血管网络。进一步分析发现大多数动脉环培养物中，新形成的微血管跟动脉环的内皮细胞层相通。形成血管腔内表面的内皮细胞被拉长，互相交迭形成单细胞或多细胞桥。通过生成内皮细胞通路，大面积的纤维蛋白胶表面发生重构，网络和微血管形成。这种结构的形成跟血管发育的过程相同，这是最初对大鼠动脉环新生微血管的形态描述。    1987年，Nicosia报道了细胞外基质对动脉环血管新生的影响5。动脉环初始培养物中，内皮细胞实体芽（endothelium solid bud）的细胞外基质主要为纤粘连蛋白、V型胶原、原纤维、层粘连蛋白

4、和型胶原蛋白组成的非组织沉积物、也发现了由、型胶原蛋白构成的少量纤维。纤粘连蛋白密集，表明是培养血管发育中临时亚细胞基质的主要成分。随着培养的进行，新生微血管内皮细胞的内质网和分泌小泡中纤粘连蛋白、层粘连蛋白及、型胶原蛋白染色阳性，表明内皮细胞能有效合成和分泌这些物质。Nicosia认为，毛细血管发育过程中，微血管细胞外基质经历了明显的动态变化。细胞外基质的不同成分和结构，在血管生成的不同阶段，对内皮细胞行为和毛细血管形态发生起到重要作用。    1990年，Nicosia等首次将此模型应用到血管发生的研究中6。用纤连蛋白胶或胶原蛋白胶包埋大鼠主动脉环，用无血清M

5、CDB 131培养基培养，主动脉环产生分枝的微血管，其血管生成作用受到自身限制。通过每天对活体培养物新生微血管计数，可进行定量分析。用不同的胶培养大鼠主动脉环，新生血管的生长曲线不同。胶原胶包埋的主动脉环，培养1周后长到顶峰，第2周开始萎缩。纤粘连蛋白胶包埋的主动脉环，能使顶峰期维持更长，而且新生血管数量是前者的230%。因此，用无血清培养基培养主动脉环，可以对新生血管定量，还能有效筛选影响血管生成的物质。此后，大量论文用此模型来筛选影响血管生成的物质711，尤其是抑制血管生成的物质。    2  动脉环模型的优化    动

6、脉环模型曾经主要用于筛选血管生成抑制剂。目前，此模型经历了诸多改进，其应用方法更为灵活，应用范围日益广泛。    2.1  转基因技术的应用  动脉环模型可以研究血管生成的分子机制。Masson等12首次通过转基因技术，用基因缺陷的小鼠研究血管生成的分子机制。由于血管生成过程包括细胞外基质蛋白的水解，因此Masson等分别用MMP、MMP11和PA1缺陷小鼠主动脉环模型，研究了丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMP）在血管生成中的作用。结果表明，缺少MMP、MMP11不会影响血管生成。而血浆酶原活化抑制剂（PA1）的缺乏则会影响血管生成。Zhu1

7、3对GFPTie2转基因小鼠进行主动脉环培养时，用GFP标记新生血管，这样可以通过绿色荧光很容易地看到新生成的血管，并发现小鼠主动脉环在无血清培养基中不会自发的生长出微血管，必须添加bFGF和VEGF。12个月的小鼠的主动脉环比610个月龄小鼠主动脉环生长血管多而且快。在添加bFGF和VEGF的情况下，不同种类的小鼠主动脉环的血管生长状况也不同。Alian等14对大鼠主动脉环模型进行了两点改进，从而使病毒介导的基因转染更为有效：将主动脉环置于胶原薄层的上方，使之能够被病毒接近。在包埋主动脉环之前，先对主动脉环进行病毒转染。因为由于腺病毒和痘病毒载体的有效转染能够引起主动脉环死亡。因此，研究用带

8、有VEGF和IFN基因的反转录病毒载体转染主动脉环。VEGF的高表达可以促进血管生成，而IFN的高表达能产生抗病毒作用。此实验系统开创了基因治疗血管疾病的新途径。    2.2  免疫组化技术的应用  Zhu等15将包被主动脉环的基质胶减少到25l,直接覆盖于主动脉环上方，简化了琼脂圈的操作步骤，而且能够对长出的血管进行全标本的免疫组化。用内皮细胞标志蛋白的抗体抗CD31和Tie2的抗体（griffonia simplicifolia isolectinB4），以及平滑肌细胞标记蛋白的抗体抗平滑肌肌动蛋白抗体，并结合免疫荧光双标和激光扫描共聚焦

9、显微镜观察，可以在同一培养体系中同时观察内皮细胞和肌细胞。这种方法可以快速发现长出的血管，并对调控血管生长的蛋白进行定位。    2.3  微阵列技术的应用  羧基氨基三唑（CAI）在体内外均有抗血管生成活性，Zogakis等16用微阵列技术研究CAI处理主动脉环后，主动脉环基因表达发生变化。抗血管生成药物CAI处理大鼠主动脉环5d，能显著抑制微血管的生长。收取CAI处理后的主动脉环，提取RNA，用cy5和cy3标记的dUTP产生靶标序列，用微阵列分析CAI处理组及对照组基因表达谱的变化。初步发现，基因表达量呈3倍变化的有40个基因。为了进一步

10、证实微阵列技术的有效性，他们又用实时定量PCR技术分析用微阵列技术发现的两个基因，得到一致结果。而且，还对CAI处理前后的人脐带静脉环基因表达谱的变化进行了研究，基因表达量呈3倍变化的有32个。因此，微阵列分析可以用来研究大鼠主动脉环模型或人脐带静脉环模型中基因表达变化，人脐带静脉环模型可以消除种间差异，更好的筛选抗癌药物。对动脉环血管生成模型进行微阵列分析，可以阐明参与血管生成的基因和通路，进一步从分子水平阐明血管生长的分子调控机制。    2.4  观察方法的改进  传统方法是通过倒置相差显微镜观察，对新生微血管进行计数，耗时而且麻烦。新兴

11、的计算机辅助成像分析以及自动化成像分析技术，可以确定动脉环的面积和形态，微血管的数目，分枝的总数，最大的微血管长度和微血管分布，分离的成纤维样细胞的总数和它们的分布。此方法适合于量化自发的血管生成以及分析各种浓度的VEGF诱导的复杂的微血管网络17，18。另外，比色法可以对血管生成活性进行定量。Wang等19用该法测定已知的抗血管生成因子SU5416，suramin,paclitaxel和2methoxyestradiol的IC50值，结果跟成像分析的结果一致，而且重复性好。Zhu等13用GFPTie2转基因小鼠分离的主动脉环产生GFP标记的新生血管，可以通过绿色荧光很容易地检测到新生的血管。

12、Miao等20将新生微血管进行吖啶橙染色，可在激光扫描共聚焦显微镜下对新生血管的形态、数目和分布等进行分析。    2.5  应用范围的扩大  传统上的血管生成模型多数用大鼠主动脉环为材料，目前，此模型也可用人脐带静脉环、小鼠主动脉环、大鼠下腔静脉21及猪颈动脉环22建成，取材范围扩大，可根据不同的目的选用不同的材料。另外，Nicosia等对大鼠动脉环和下腔静脉环进行共培养，能形成微血管的吻合网络，因此，可用此模型研究动静脉吻合发生的分子机制21。    3  小  结    肿瘤血管生成的研究模型分为体外模型和体内模型两大类。肿瘤血管生成的体外研究模型，主要是用体外细胞培养的方法，进行内皮细胞培养，同时加入某种促血管生成因子，观察其对血管生成的影响。肿瘤血管生成的体内研究模型主要有动物（大鼠，兔等）眼角膜囊（眼前房）、地鼠颊囊、裸鼠外耳皮下和鸡胚绒毛尿囊膜等动物模型。肿瘤血管生成的体外模型不能很好地反应体内所处的复杂内环境，