MRSA对万古霉素和去甲万古霉素体外诱导耐药性研究

1、    MRSA对万古霉素和去甲万古霉素体外诱导耐药性研究        摘要目的：为防止临床耐万古霉素耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的产生。方法：采用4倍万古霉素(VNC) MIC和去甲万古霉素(NVNC) MIC分别对MRSA进行体外耐药诱导；以琼脂双倍稀释法测定诱导前、后细菌药敏。 结果：20株MRSA分别经4倍VNC MIC 和NVNC MIC非连续性诱导培养20代，无耐VNC或NVNC MRSA变异株产生；但经10次以上诱导培养后，VNC和NVNC分别对MRS

2、A的抗生素后效作用消失。结论：VNC或NVNC诱导产生耐VNC MRA或耐NVNC MRSA相当困难，但随着培养诱导次数增多，MRSA对VNC、NVNC或NVNC能产生一定耐受性改变。提示随着VNC临床实用价值增高、范围扩大及次数增多，诱导产生耐VNC或NVNC MRSA可能性会越来越大，故强调尽量减少临床VNC或NVNC使用尤为必要。关键词耐甲氧西林金黄色葡萄球菌万古霉素去甲万古霉素诱导耐药中国书资料分类法分类号R978.1Studies on in-vitro induction of resistance in Methicillin-resistant Staphyloccus aur

3、eus to vancomycin and norvancomycin Ye GaofengMa LanWei HuaZhang XiuzhenZhang YanxiaXu Yeqi No.466 Hospital PLA, Beijing 100089AbstractOBJECTIVE In order to control the resistance in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) to vancomycin (VNC) and norvancomycin (NVNC) were studied. METHODS

4、 Twenty strains of MRSA were separatedly subcultured in broth media containing four times inhibitory concentration of either VNC or NVNC. The susceptibility to antibacterial agents was tested by agar dilution method. RESULTS None of the NVC or NVNC-resistant variants was seen, but the post-antibioti

5、c effects (PAES) induced by VNC or NVNC disappeared after 10 passages of culture. CONCLUSION The in-vitro induction of resistance to VNC of NVNC is very difficult, but MRSA can acquire some resistance to VNC or NVNC with the increase of inducing passages. The findings suggest that it may be more lik

6、ely to induce resistance in MRSA to VNC or NVNC with the increase of clinical use value, frequency and width. Therefore, it is particularly necssary to limit the clinical use of VNC or NVNC as possible. Key wordsMRSAVNCNVNCInducing resistance 至今治疗各种革兰氏阳性菌包括球菌与杆菌感染最有效的抗菌药物仍为万古霉素(Vancomycin VNC)。然而，耐万

7、古霉素的肠球菌和凝固酶阴性的葡萄球菌已出现，且肠球菌的耐药基因可转入葡萄球菌已见报道1，人们对此极大关注。控制耐万古霉素葡萄球菌的产生成为抗感染医学研究的热门课题。本文就临床分离的耐甲氧西林金葡球菌MRSA对VNC和国产去甲万古霉素(Norvancomycin NVNC)体外诱导耐药进行比较研究。1材料1.1菌株20株MRSA均为1997年16月从北京医院临床血液标本分离而来，并经VITEK-AMS操作程序用GPT鉴定卡上机鉴定。MRSA菌株判定按照NCCLS规定的微量肉汤稀释法进行2，在MNB中加入2%氯化钠，抗生素使用苯唑西林，接种菌浓度为5×105CFUml，35孵育24h后观

8、察MIC4mgL。标准质控菌为金葡菌ATCC25923。1.2抗菌药物VNC为美国Lilly公司产品，批号X-950561；NVNC批号96702。1.3培养基MH肉汤培养基为美国Difco公司产品；MH琼脂培养基、营养肉汤由中国药品生物制品检定所购进；血琼脂平板自备。2方法2.1最低抑菌浓度(MIC)测定采用平皿2倍稀释法和多点接种器定量种菌进行药敏实验。试验菌用营养肉汤增菌，分别将VNC及NVNC配制贮液，用MH肉汤2倍稀释成各种所需浓度，分别加适量到平皿中，MH琼脂培养基溶化后定量注入含药物平皿内混匀，药物的终浓度分别为0.065、0.125256ugml，试验菌接种量为105CFU点，

9、接种后置37恒温培养24h，无可见菌生长的平皿中所含药物最低的浓度确定为MIC。2.2耐药变异株的诱导据VNC、NVNC分别对各菌株的MIC，将上述两种药物分别配制成4倍MIC浓度于4ml营养肉汤的试管中，接种细菌约107CFU，置于37下恒温孵育4h，转种无菌物血琼脂平板上恒温37孵育20h。经在含抗菌药和不含抗菌药培养基中连续20次(代)转代培养，每间隔5次(代)鉴定菌种及鉴定菌种及检测VNC、NVNC对各菌的MIC。若药物诱导后MIC4倍诱导前MIC则定为耐药。2.3诱导菌株的生长性状、时间和频率分别取未经抗菌药和经4倍VNC或NVNC MIC浓度第5次、第10次、第15次、第20次孵育

10、培养菌的0.1ml标本，种植在无药物血琼脂平板上恒温37孵育、於18h、36h、54h观察其菌落生长性状；分别取未经抗菌药和经4倍VNC或NVNC MIC浓度第5次、第10次、第15次、第20次孵育培养菌的0.1ml标本，用10倍生理盐水系列稀释。以每种稀释液的0.1ml分别种植在不含有抗菌药物的MH琼脂培养基平皿上，置于37恒温孵育，分别於18h、36h、54h做菌落相互计数比较。3结果3.1经VNC诱导20株MRSA，有16株对VNC的MIC(18mgL平均5.62mgL)较诱导前MIC(18mgL平均1.75mgL)普遍提高，但提高幅度只在2倍之内；另4株VNC的MIC与诱导前相同；经N

11、VNC诱导，有14株对NVNC的MIC(18mgL，平均6.1mgL)较诱导前(0.54mgL，平均1.5mgL)普遍提高，但提高幅度只在3倍之内；另6株NVNC的MIC与诱导前相同(见表1)。VNC NVNC分别对诱导前20株MRSA的MIC平均值分别为2.05mgL、1.82mgL；二者间无显著差异(t=0.409，P0.05)。VNC、NVNC分别对VNC、NVNC诱导后20株MRSA的MIC平均值分别为5.15mgL、5.05mgL；二者间无显著差异(t=0.4，P0.05)。3.210株MRSA经VNC诱导不同次(代)菌株生长的时间-频率(见1)；经VNC诱导5代、10代菌株转种普通

12、血平板上培养36h，菌落细小(直径2mm)，菌落周围溶血现象减弱；培养54h，菌落生长形态正常；转种无抗菌药MH琼脂培养皿上孵化18h、36h、54h平均生长频率分别为1049、104、101；104.2、103.8、100.7。经VNC诱导15代、20代菌株在血平板上培养18h，菌落生长性状良好；在无抗菌药MH琼脂培养皿上孵化18h、36h、54h平均生长频率分别为100.9、100.7、100.4；100.7、10-0.7、100.5、100.2。经NVNC诱导5代、10代、15代、20代菌株分别在血平板、无抗菌药MH琼脂培养皿上培养18h、36h、54h，菌落生长性状、时间和频率变化均同

13、VNC相同。表1VNC、NVNC对NVC、NVNC诱导前、后20株MRSA的MIC(mgL)菌株诱前VNC MIC诱前NVNC MIC诱后代数诱后代数510152051015201124241.021242112221.024243122240.521124214281.021245224242.048486242482.022227124240.512248111111.011119222442.0424810224242.0222211221222.0484812448484.0444413888884.0444414222222.0484815122441.0242416124242.0

14、212217242482.0484818224482.0284819224882.0484820224482.04488         1MRSA经VNC诱导不同次(代)菌株生长的时间频率曲线4讨论引起医院感染的能力及致病性很强的MRSA，近年来在临床标本检出率迅速增高，不少大医院MRSA检出率约占分离葡萄球菌的80%3。MRSA感染危险性和治疗困难性越来越大，人们对治疗MRSA感染有效的糖肽类抗菌药VCN、NVCN寄于重望。故有关MRSA对VCN耐药问题研究倍受人们重视。本研究结果表明VNC对经VNC杀菌浓度(

15、4倍MIC)存活期内诱导培养20次MRSA的MIC仅较诱导前提高两倍，未能诱导耐VNC MRSA变异株产生。这与美国学者Chatrchai Watanakvnalvrn采用VNC次抑菌浓度(12 MIC)连续传代诱导MRSE 25次，未能诱导产生耐VNC MRSE的研究结果相同4，均证实体外诱导耐甲氧西林葡萄球菌对VCN产生耐药相当困难。该结果与VNC被应用于临床近40年，其耐药性未见增加，仍是目前治疗各种严重革兰氏阳性菌感染，特别是对其他抗菌药耐药或疗效差的MRSA、MRSE及肠球菌属所致感染效果可靠这一临床事实相一致。细菌在体外或体内均不易产生对VNC耐药性可能与VNC除了作用于细菌细胞壁

16、与粘肽的侧链形成复合物，从而抑制细胞壁的蛋白合成外，还改变细胞膜通透性及选择性抑制RNA合成等多种作用机理有关。结果显示国产NVNC对经NVNC杀菌浓度(4倍MIC)存活期内诱导20次MRSA的MIC仅较诱导前提高3倍，未能诱导耐NVNC MRSA变异株产生；经NVNC诱导前、后的MIC平均值分别同VNC诱导前、后的MIC平均值无明显差异(P0.05)；证明NVNC体外抗菌活性同NVC相似，在体外也同样不易诱导耐药性产生。提示临床使用国产NVNC治疗 MRSA感染症的可靠性和稳定性。本研究发现，MRSA经4倍VNC MIC或4倍NVNC MIC诱导5代、10代转种血平板或MH琼脂培养皿上培养，

17、在36h内菌落生长，畸形改变，菌株出现频率低(约平均104.2)，但经VNC或NVNC诱导至15代、20代，18小时内菌落生长形态正常，菌株出现频率高(约平均100.8)；表明MRSA经VNC或NVNC短期杀菌浓度反复接触后，VNC或NVNC的后效作用将消失；说明尽管MRSA经VNC或NVNC体外诱导耐药性难以产生，但能产生一定的耐受性改变；随着诱导时间延长、VNC或NVNC诱导耐药可能性是存在的。提示随着VNC临床实用价值增高，其临床应用范围扩大，应用次数增多，VNC或NVNC诱导耐药性出现可能性及加快耐药出现的趋势越来越大。因此，临床应尽量减少VNC应用，如可能情况下，应口服甲硝唑或替硝唑

18、而不是VNC治疗与抗生素相关性结肠炎；VNC仅限于对其他抗菌药耐药或疗效差的MRSA、MRSE及肠球菌属所致感染，同时应对耐VNC菌株进行严密监控，以防止和延缓耐VNC MRSA的出现和播散极为重要。作者单位:马兰张秀珍北京医院魏华解放军总医院张延霞解放军第304医院叶高峰许也齐解放军第466 医院北京100089参考文献1贺全仁, 陈孝治. 耐甲氧西林金葡球菌的药物防治. 国外医药抗生素分册, 1997, (6): 4222National Committee for Clinical Laboratory Stan dards. Approved standard M7-A3. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically-Third