细胞培养步骤

1、花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养1.细胞培养准备工作准备工作的内容包括器皿的清洗、 干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装 及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。具体工作 如下：一、清洗(1) 常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻 璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀、解剖 针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、离心管、细胞冻存管、酒精 灯、试管架、超净工作台、倒置显微镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封 口膜、喷壶、以及洗刷用品等。(2) 玻璃器皿清洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶(瓶盖不泡盐酸，清洗赶紧 后直接咼压火

2、菌)等玻璃器皿自来水刷洗，除去灰尘，烤箱中烘干，然后 再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。泡盐酸 12小时后 立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净，然后用蒸馏水冲洗 干净后用烤箱烘干，高压灭菌，烘干备用。(3) 塑料器皿的清洗：细胞培养皿、培养板、培养瓶可以直接使用，进口枪头、 进口离心管高压灭菌。(4) 金属制品的清洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗，后 用自来水冲干净，然后用 75%酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲 洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。(5) 棉织品：纱布和脱脂棉，高压灭菌，再烘干备用。二、溶液配制(1

3、) PBS:配方一|-用电子天平准确称取 NaCI / g，KCl / g，KH2P04/ g，Na2HP04-12HD/ g溶于800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节 pH值为，然后定容至1L。置于高压灭菌锅中灭菌30min,冷却到室温后分装，于4C冰箱冷藏备用 配方二卜-等渗(1X PBS细胞培养用，用电子天平准确称取 NaCI/浓度为8/=，本配方主要靠 NaCI, KCJ/浓度为=，NqHPQ 12H0/浓度为358=, NaHPO 2H0/浓度为 358=，KH£OL浓度为 136=，溶于 800 mL的 dddH20 用玻璃棒搅拌至溶解，dddH20定容至100

4、0ml。置于高压灭菌锅中灭菌 30mi n，冷却到室温后分装，于 4°C冰箱冷藏备用。配方三 -用电子天平准确称取 NaCI / g，KCI / g，KHP04/，NaHPO7H0/ g，MgCL 6fO/，CaCL/溶于800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至 溶解后调节pH值为，然后定容至1L。置于高压灭菌锅中灭菌 30min, 冷却到室温后分装，于4C冰箱冷藏备用。(2) %胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末(1:250)，用PBS在容量瓶中定容至100ml， 微孔滤膜过滤除菌，分装，于20 C保存。(3) %胰蛋白酶 EDTA消化液：准确称取的Trypsin和的EDTA用PBS在容 量

5、瓶中定容至100ml，调节pH值为，用孔径为ym的滤膜过滤除菌，用 2mL的离心管分装，冻存于-20 C冰箱备用。(4) 培养基：基础培养基MEM这是使用最为广泛的培养基；完全培养基配置 方法为：1L MENS础培养基添加HEPES充分溶解后，用NaOP将PH调到， 加 2ng/ml bFGF，20%、牛血清，1mmoI/L 的 L-谷氨酸，50mmoI/L 的 2-巯 基乙醇，100IU/mI青霉素和100ug/ml链霉素。(5) HEPES溶液：配置100X贮存液(1moI/L )，在99ml培养液中加入1ml贮存液，使最终浓度任为10mmol/L。100X贮存液(1moI/L )配置方法

6、：取 溶于90ml双蒸水中，用1moI/L NaOH调卩日至，然后用水定容至100ml， 过滤除菌，分装2ml小瓶，4C或-20 C保存。三、培养室的灭菌(1) 室内灭菌：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用新洁尔灭擦拭。(2) 生化培养箱灭菌：先用3%。新洁尔灭擦拭，然后用70%酒精擦拭，再用 紫外灯照射。保持培养箱内空气干净，定期消毒。定期更换蒸馏水。(3) 实验前灭菌：打开紫外灯20-30分钟。(4) 实验后灭菌：用70%酒精(3%o新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微 镜的载物台，打开紫外线照射 20-30min。四、实验人员的无菌准备：(1) 肥皂洗手。(2)

7、穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、穿好鞋套。(3) 戴乳胶手套，75%酒精擦手。五、无菌操作(1) 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用70% 酒精擦拭瓶子的外表面。(2) 靠近酒精灯火焰操作。(3) 打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近。(4) 无菌级；别高的物品不能触碰无菌级别低的物品。手不能从敞开的瓶口 上方经过。(5) 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到 废液缸。(6) 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。(7) 手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端。(8) 尽可能移走不需要的物品，在操作中经常用酒精擦拭台面。(9)

8、尽可能减少开盖时间。(10) 随时擦去任何溢出物。六、原代细胞培养方法一：组织块培养法(主要用于肌肉组织的培养)(1) 选取身体健康，无病的幼鱼，用解剖针进行头颅穿刺法杀鱼，70%酒精消 毒体表，然后放在无菌的培养皿中，待用。(2) 解剖鱼体，拿入无菌操作台中，用无尘纸垫在鱼体下，用直头解剖剪剔 除皮肤，取体表肌肉组织，然后剥去内脏膜取肝脏组织并刮去多余的外膜，放入培养皿，用PBS青洗三遍，放入70%酉精中消毒34mim再用 PBS青洗3遍，除去血块，用加入双抗的无血清培养基清洗一遍。(3) 切割组织块，用解剖刀在培养皿上切割组织，切割过程中，加入适量的 培养液保持组织湿润。(4) 悬浮移瓶，

9、切割完成后用新鲜的培养基悬浮小组织块，用移液枪移入培 养瓶中，吸弃上清液，保留少量培养液，盖上瓶盖，轻轻晃动瓶子，使 组织块在瓶底均匀铺展开，用玻璃棒调整组织块使其均匀分布，组织块 间隔为宜，25亦培养瓶中加入2030个组织块。(5) 细胞贴壁，将培养瓶在培养箱中平放 2小时，使组织贴壁，然后侧放半 个小时，使液体浸出，然后吸出液体。(6) 细胞培养，从培养瓶边角加入3ml培养基，盖上瓶盖，满满放入培养箱 中平放培养。如有悬浮，需重新贴壁。(7) 初始培养5天后换一次培养基，后期每隔 2-4天换一次培养基。换培养 基的时候，吸走一半旧的培 养基, 再加入一半新的培 养基。(8) 观察、记录细胞

10、迁出情况，适时拍照。13天内迁出较少，尽量不要观察。 方法二：酶消化解离法(除肌肉和结缔组织之外)(1) 选取身体健康，无病的幼鱼，用解剖针进行头颅穿刺法杀鱼，70%酒精消 毒体表，然后放在无菌的培养皿中，待用。(2) 解剖鱼体，拿入无菌操作台中，用无尘纸垫在鱼体下，用解剖剪打开腹腔(注意不能碰破肠道)，剥去内脏膜取肝脏组织并刮去多余的外 膜，放入培养皿，用PBS清洗三遍，放入70%酒精中消毒34mim再用 PBS清洗3遍，除去血块，使肝脏呈灰白色，用加入双抗的无血清培养基 清洗一遍。(3) 胰酶消化，将组织切割成 1mm大小，用胰蛋白酶 EDTA消化液消化 20min后添加3ml完全培养基终止消化，收集含有组织块的细胞悬液，以2200rpm离心2min；将所得沉淀用1ml完全培养基悬浮后接种