过滤技术对血液中肿瘤细胞去除作用的可行性研究

1、过滤技术对血液中肿瘤细胞去除作用的可行性研究宁吉顺 王惠霞 高成杰 类维富作者单位：济南军区总医院麻醉科，济南市，250031通讯作者：类维富，山东大学齐鲁医院麻醉科工作，济南市，250012 摘要 目的：观察白细胞过滤器能否将血液回收机漂洗后残存的肿瘤细胞彻底清除；观察经白细胞过滤器过滤后红细胞的形态学及其Na+-K+ATP酶活性是否发生改变。方法：选择胃肿瘤细胞SGC-170以及肠肿瘤细胞LOVO，进行培养，待细胞消化后制成单一细胞悬液，采集非肿瘤患者术野血液，经过滤、离心、漂洗，采集到浓缩红细胞。将细胞悬液中的肿瘤细胞计数后放入浓缩的红细胞中，混匀。将混有肿瘤细胞的浓缩红细胞采用血液回收

2、机将其过滤、离心、漂洗，将漂洗后得到的浓缩红细胞用白细胞过滤器过滤，观察过滤后肿瘤细胞形态学的改变，测定红细胞Na+-K+ATP酶，观察红细胞的形态及活性。结果：经过白细胞过滤器过滤后的血样中未发现肿瘤细胞，而对照组中可见到肿瘤细胞。将血样稀释10倍后置于1640培养液中培养14天。发现过滤后的血样未见肿瘤细胞生长，而对照组有大量的肿瘤细胞生长，过滤后的红细胞形态学未发生明显改变，Na+-K+ ATP酶含量与对照缚相比，统计学无显著性差异。结论：自体血液回收机配合白细胞过滤器，可完全去除血液中的肿瘤细胞，对红细胞形态及Na+-K+ ATP酶活性未产生明显影响。 关键词：回收式；自体输血；白细胞

3、清除过滤器； Na+-K+ ATP酶Effect of leucocyte depletion filter on contaminating tumor cells and red blood cells in intraoperative autotransfusion bloodObject: whether leucocyte depletion filter could remove the left tumor cells that were being washed through the cell saver, whether the morphology of the red

4、 blood cell was changed through cell saver and leucocyte depletion filter, whether the Na+-K+ ATP dipase of the red blood cell was changed. Methods: Red blood cell concentrate was inoculated with intestiual cancer cell LOVO and gastric cancer cell SGC. The blood was centrifuged, washed through cell

5、saver, the tumor cells was then isolated from centrifuge, and the living tumor cells could be calculated with trypan blue and cultured. The left tumor cells after being washed through cell saver went filtered through the leucocyte depletion filter, and the living tumor cells could be calculated with

6、 typan blue and cultured, unwashed and unfiltered blood was used as a control and then cultured. The left tumor cells after being washed and filtered were cultured for two weeks. The colony forming assay was analyzed by microscopy. At the same time the morphology and the Na+-K+ ATP dipase of the red

7、 blood cells. Conclusion: Cell saver can not completely remove malignant cells from blood; After being washed through cell saver and being filtered through leucocyte depletion filter, the malignant cells in blood can be completely removed; The morphology and the Na+-K+ ATP dipase of the red blood ce

8、lls are not changed after being washed through cell saver and being filtered through leucocyte depletion filter.Key words: intraoperative autotransfusion; leucocyte depletion filter; Na+-K+ ATP自体血液回收技术的推广应用对血液保护的实施发挥了巨大作用。但由于肿瘤患者，采用自体血液回收技术并不能将血液中的肿瘤细胞彻底清除1。本研究在应用自体血液回输技术联合白细胞过滤器，观察能否将血液中的肿瘤细胞彻底清除，是

9、否对红细胞产生影响。1 资料与方法1.1 资料选择胃肿瘤细胞SGC-170以及肠肿瘤细胞LOVO，进行培养，接种于RPMI1640培养基，在37、5%CO2细胞培养箱中培养一周，用机械和0.25%胰蛋白酶消化，待细胞成熟后吸出，制成单一细胞悬液。肿瘤细胞株均经山东大学齐鲁医院病理科组织学鉴定未发现畸形细胞。1.2 研究设备 自体血液回收机Cell Savers（美国血液公司）；白细胞过滤器（南京双威实业公司生产）；Eppendorf centrifuge 5804R冷冻离心机；UV/vis 7530-G分光光度仪5.5%CO2细胞培养箱。ATP酶测试盒：南京建成生物工程研究所制备。测定高速冷冻

10、后红细胞膜的ATP酶活性；RPMI1640培养基（GIBCO公司生产）Brdu肝素（Sigma公司）；PDGF小鼠抗Brdu（Oncogene Science公司）。2 方法2.1 取肿瘤细胞进行培养，待细胞消化后制成单一细胞悬液，观察肿瘤细胞的活性。2.2 采集非肿瘤患者术野血液，回收入血液回收机贮血罐，经过滤、离心、漂洗，采集到浓缩红细胞200ml。2.3 将细胞悬液中的肿瘤细胞计数后放入浓缩的红细胞中，混匀。取出7ml血样做对照。将混有肿瘤细胞的浓缩红细胞采用血液回收机将其过滤、离心、漂洗，得到浓缩红细胞。2.4 将漂洗后得到的浓缩红细胞用白细胞过滤器过滤，过滤后的血样取7ml。其中5m

11、l加入Percall分离液中，经离心分离肿瘤细胞，台盼蓝染色计数浓缩红细胞中存活的肿瘤细胞。并将肿瘤细胞培养。剩余2ml血样测定红细胞Na+-K+ ATP酶，观察红细胞的形态及活性。2.5 将对照血样、过滤后的血样各稀释10倍，经转速为2000rpm/min密度梯度离心30min，取中间层肿瘤细胞（密度1.021.05），接种于直径35mm的1640培养皿中，置于37 、5%CO2细胞培养箱中进行培养。静态培养14天。14天后将肿瘤细胞收集，观察肿瘤细胞的形态是否改变，是否有克隆形成，并对肿瘤细胞台盼蓝染色进行计数。2.6 红细胞Na+-K+ ATP酶活性测定。蛋白质测量为280nm紫外比色，

12、以牛血清的蛋白为对照，浓度为5mg/ml。三次试验计算红细胞Na+-K+ ATP酶的活性。2.7 离心、过滤对红细胞质量的影响，随机选取5目，细胞数在60个以上，且细胞疏密程度适中的1000倍视野进行拍照。在400倍的放大率下，浏览整张玻片，观察血样中杂质微粒的大小及数量。3 检测观察的指标3.1 观察过滤后肿瘤细胞形态学的改变，同时台盼蓝染色观察肿瘤细胞数目的改变，并与对照组进行比较。3.2 将过滤后的肿瘤细胞培养两周进行克隆形成试验。与对照组相比较，观察细胞克隆形成情况，台盼蓝染色计数肿瘤细胞的数目。3.3 过滤后红细胞形态学改变，并进行Na+-K+ ATP酶含量测定，并与对照组比较。3.

13、4 观察过滤后非血液成份中的碎片和微粒。4 统计学处理红细胞Na+-K+ ATP酶油定结果，数据采用±S表示，采用t检验。检验水准=0.05，p<0.05为有显著性差异。结果1经白细胞过滤器过滤后的血样中未发现肿瘤细胞，而对照组中可见到大量的肿瘤细胞，见图1，2。2克隆形成实验将血样稀释10倍后置于1640培养液中培养14天。发现过滤后的血样未见肿瘤细胞生长，而对照组有大量的肿瘤细胞生长，见图3、4。3红细胞的形态学及Na+-K+ ATP酶含量测定过滤后的红细胞形态学未发生明显改变，Na+-K+ ATP酶含量与对照组相比，统计学无显著性差异，见表1。4过滤后的红细胞质量及形态变

14、化扫描电子显微镜所见：回收血液清洗前均有较多细胞碎片及微小组织碎屑，其中组织碎屑以骨屑、肌肉组织为主。漂洗后，细胞碎片明显减少，但仍可见少量组织碎屑等非血液优分微粒。PALL 40SQ型微聚体输血滤器过滤后，视野中非血液成分微粒明显减少。表1 红细胞Na+-K+ ATP酶测定结果（±S，n=3）处 理Na+-K+ ATP酶（umol pi/mg pro/hr）对 照0.137±0.034漂 洗0.125±0.026过 滤0.122±0.022与对照组比较，p>0.05，无显著性差异。图1 对照组细胞培养七天时（×400）图2 过滤后细胞培

15、养七天时（×400）图3 对照组细胞培养两周时（×400）图4 过滤后细胞培养两周时（×400）讨论随着外科手术的发展，晚期困难肿瘤手术病人术中常伴随大量的出血，多需要输注异体血补充血容量，据不完全统计约有1/4的库血用于肿瘤手术中。这些病人面临因输异体血而带来的并发症和危险，尤其对于肿瘤病人，由于免疫力的被抑制造成的感染、传染病和肿瘤复发率的上升。虽然有人主张肿瘤自体血可回输，但大多局限于离心、漂冼的研究。去白细胞过滤器避免了由白细胞引起的输血反应、非溶血性发热反应（NHFR）、成人呼吸窘迫综合征、输血后移植物抗宿主症（GVUD），减弱了亲细胞病毒感染。Kong

16、sgaard2，利用白细胞过滤器RC400将自体回收血中乳腺癌细胞PM1和MGF7清除掉，其过滤后的血液中并未发现具有活性的肿瘤细胞，Wisel3采用自体血液回收机（Althin Mediplast）和去除白细胞过滤器（Pall RC 100），处理含有肿瘤细胞（膀胱、前列腺、肾癌细胞）的红细胞，结果发现经处理后肿瘤细胞可被彻底清除。Edelman-MJ4则分别将同样的肿瘤细胞通过去除白细胞过滤器（LDF）和去除红细胞过滤器（SBF），并将过滤后的细胞行台盘蓝染色，同时进行细胞培养，发现无论台盘蓝染色还是细胞培养，结果均提示LDF可完全去除肿瘤细胞，而血液回收机离心、漂洗不能将肿瘤细胞完全去除

17、。本次实验选用具有繁殖能力的肠肿瘤细胞与胃肿瘤细胞，将其计数后放入浓缩的红细胞中。在血样培养的过程中动态观察肿瘤细胞的生长情况。结果，培养7天时，对照样本有克隆形成，漂洗后血样及过滤后血样均未发现有克隆形成；培养14天后，过滤后血样未发现有肿瘤细胞生长，对照样本、漂洗后血样均有大量的肿瘤细胞团。而过滤后血样仍未见有克隆形成，从而进一步证明了第四代白细胞过滤器可完全去除肿除细胞。白细胞过滤器由于其过滤介质仅0.3-3um，并且交织成非编织的网状结构，因而能够比较有效地去除肿瘤细胞。本实验证实，过滤后台盼蓝染色未发现肿瘤细胞，培养14天后亦未发现有肿瘤细胞克隆形成，DNA代谢物测定未发现具有繁殖能

18、力的细胞存在。而红细胞由于直径小、无核并且具有变形性，可以通过滤网而不发生形态破坏，其生理功能也不受影响。从血液中去除肿瘤细胞的前提是不损伤红细胞。红细胞呈双凹圆碟形，在全身血管中循环运行时，可挤过口径比它小的毛细血管和血窦孔隙。在此过程中，红细胞可发生卷曲变形，在通过后又可恢复原状，其可塑性较好。实验中我们采用等渗氯化钠盐水，因此在血液漂洗机离心、漂洗过程中，能够维持其形态的稳定性，而不易发生水肿、破裂。实验中研究者应用了较为可靠的红细胞Na+-K+ ATP酶活性检测红细胞功能及显微镜观察红细胞的形态。结果显示：显微镜下未发现红细胞有明显的形态学改变。通过实验结果可看出，采用血液回收机离心漂洗不能彻底清除，在红细胞与肿瘤细胞的分层界各种细胞是混杂的，不能保证所有的肿瘤细胞能完全与红细胞完全分离开，因此直接回输是不安全的。而白细胞过滤器（如RC400TE）由于限制了通过滤网的细胞直径，从而安全、有效地禁止肿瘤细胞通过。该研究实验证明，通过血液回收机的离心、漂洗配合白细胞过滤器的应用可清除血液中混杂的肿瘤细胞，同国外多数研究相同。配合使用白细胞过滤器进一步增加了肿瘤外科手术中自体血液回输的安全性。参考文献1Hansen E, Waff