GhWRKY3,anovelGossypiumhirsutumLWRKYgene,isinvolvedindiversestressresponses

1、GhWRKY3, a novel cotton (Gossypium hirsutum L.) WRKY gene,is involved in diverse stress responsesRuoyu Guo Feifei Yu Zheng Gao Hailong An Xuecheng Cao Xingqi GuoReceived: 19 December 2009/Accepted: 5 March 2010/Published online: 18 March 2010 Springer Science+Business Media B.V. 20102014.12.13演讲人：蔡继

2、鸿背景背景在整个生命周期中，植物遇到各种生物和非生物胁迫。在进化中，植物已经产生了一系列复杂的响应机制，并具有通过多种信号通路感知和响应各种外部信号的能力。植物激素是多种信号通路的重要组成部分，它们通过协同或拮抗作用共同调节植物生长，发育和防御反应。转录调控机制在植物发育和环境刺激的反应中也发挥了作用，WRKY蛋白是这些转录因子成员之一，它代表一个锌指转录因子的大家族。WRKY蛋白参与了多种非生物的防御反应和发育过程，如寒冷和干旱胁迫，伤害和次生代谢产物的生物合成棉花（陆地棉）是一种重要的经济作物。虽然从棉花中鉴定了许多基因，如Ghcdh 等，但有关于WRKY转录因子是否参与介导致病菌和棉花信

3、号激素的反应没有报告。在本研究中，我们从棉花中分离出了一种新的WRKY基因，GhWRKY3，编码一个假定的I组WRKY蛋白。GhWRKY3组成型表达在根，茎和叶。SA，ABA，MeJA，ET，GA3和H2O2能使GhWRKY3的转录上调。此外，GhWRKY3的表达也受伤害和三种真菌病原体包括立枯丝核菌，炭疽菌和枯萎菌感染诱导，但不受6-BA，NAA，干旱，盐，和冷（4C）的诱导。材料与方法1.植物材料，生长条件和处理2.提取RNA，cDNA合成和DNA制备3.GhWRKY3内部保守序列的扩增4.3 and 5 RACE of GhWRKY35.GhWRKY3全长cDNA和基因组序列的扩增6.G

4、hWRKY3 的5侧翼区的克隆7.GhWRKY3的亚细胞定位8.序列分析9.半定量RT-PCR分析材料与方法材料与方法1、植物材料、生长条件和处理 棉花种子在28C时发芽，然后28C.时幼苗16 h光/暗8小时周期在温室养殖培。组织表达特异性分析：取同一植株苗期的根，茎和叶，零下80C液氮冷冻保存。a、幼苗叶片分别喷洒2mM SA，100M ABA ， 100M茉莉酸，乙烯释放乙烯利5mM，500M GA3，10M NAA ，20M 6-BA，和10mM H2O2。幼苗用无菌水对照。b、损伤，冷和盐的处理按高等人的协议。 22 。c、干旱胁迫用15% PEG6000的灌溉幼苗进行。d、真菌病原

5、处理：幼苗的根系分别蘸水稻纹枯病，炭疽病棉蚜和尖孢镰刀菌、枯萎病菌分生孢子悬浮液106孢子每毫升。各种处理下的叶片在适当的时间的收获，在液氮中冷冻，并在零下80C储存2、提取RNA、cDNA合成和DNA制备提取RNA 用Trizol试剂从植物组织提取总RNA，并用无核糖核酸酶DNaseI处理去除潜在的基因组DNA污染。cDNA合成 The first-strand cDNA was synthesized with the EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (Transgen, China) according to the man

6、ufactures protocolDNA制备 基因组DNA用CTAB法从幼叶分离。3、GhWRKY3内部保守序列的扩增获得内部保守片段，引物WP1和WP2根据拟南芥，香菜，烟草和甜马铃薯WRKY蛋白的保守氨基酸设计合成。 RT-PCR进行如下： 94C 5分钟 35个周期的94C 40秒 50C 40秒 72C 1分钟 延伸72C 10分钟 纯化并克隆PCR产物到pMD18-T载体 转化到大肠杆菌感受态细胞测序。4、3 and 5 RACE of GhWRKY33RACE以第一链cDNA为模板，特异引物为3WP1 / 3WP2。第一次PCR是通过特异引物3WP1和通用引物B26进行的。PCR

7、产物稀释十倍后与嵌套引物3WP2 和通用引物B25进行二次PCR。第一次PCR和巢式PCR反应进行了如下：预变性94C 5分钟，35个周期的94C 40秒，50 / 52C 40秒， 72C为90秒，在72最后延伸10分钟。纯化并克隆二次PCR产物到pMD18-T载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞进行测序。 5RACE，第一链cDNA的纯化是通过向导DNA清理系统。然后，纯化的cDNA在5端采用末端脱氧核苷酸转移酶基因进行多聚腺苷酸化。第一次PCR是通过5WP1和精简的锚定引物进行扩增的，然后在巢式PCR反应使用稀释的第一次PCR产物为模板，选择5WP2和精简通用引物扩增。第一次PCR和巢式PC

8、R条件为：预变性94C 5分钟，35个周期的94C 40秒，55 / 56C 40秒，72C 90秒，和延伸72C 10分钟。纯化，克隆第二次PCR产物到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌感受态细胞并测序。5、GhWRKY3全长cDNA和基因组序列的扩增根据上面获得的三个片段，通过DNAman软件5.2.2分析，推导出GhWRKY3的全长cDNA，以特异性引物WR1和WR2为引物合成和扩增GhWRKY3的全长cDNA和基因组序列。 PCR技术的方法如下： 945分钟，35个循环的9440秒，5140秒，7290秒，最后延伸7210分钟。将纯化的PCR产物克隆到pMD18-T载体，转化到大肠杆菌

9、DH5中并测序。6、GhWRKY3 的5侧翼区的克隆通过I-PCR得到GhWRKY3的5侧翼区的片段 制备模板：分别用六个限制性内切酶（HPAI，HpaII，MboI，PstI，RSAI，TaqI）完全消化棉花基因组DNA，然后用无水乙醇存放并用T4 DNA连接酶连接。 克隆：从模板用TaqI获得了5侧翼区片段,两个特异性引物WQ1，TAQ1和两个嵌套引物WQ2，TAQ2分别用于第一次和第二次PCR。PCR产物进行纯化，克隆到pMD18-T载体中测序。 进一步验证该序列的正确性:基因组DNA为模板与特异性引物WQF和WQN进行直接扩增GhWRKY3 公认的5侧翼区序列。7、GhWRKY3 的亚

10、细胞定位 GhWRKY3 的ORF没有以特异引物WG1和WG2 PCR扩增得到终止密码子。 将PCR产物克隆到pMD18-T载体，然后用BamHI和XhoI消化，在35S启动子的控制下将片段融合到GFP表达载体的N-末端。 35S：GFP作为控制子，35S：GhWRKY3-GFP融合构建体和35S：GFP的载体通过碱裂解法进行纯化。 利用粒子轰击的方法将质粒DNA转化到洋葱表皮细胞。将转化的洋葱表皮细胞在黑暗条件下12小时、25C MS培养基中进行培养。 DAPI进行细胞核染色后使用共聚焦激光扫描显微镜观察转化洋葱表皮细胞的基因表达。8、序列分析DNA和蛋白质序列分析DNAman软件5.2.2

11、和BLAST软件在线（/blast）GhWRKY3和其他WRKY蛋白的系统进化树分析MEGA4.1GhWRKY3蛋白预测定位在线工具PSORT程序（http:/psort.ims.u-tokyo.ac.jp）GhWRKY3公认的5侧翼区序列分析PlantCARE数据库（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）9、半定量RT-PCR分析通过半定量RT-PCR进行研究GhWRKY3的表达模式，以WRT1和WRT2为引物设计不同处理条件下GhWRKY3表达的研究。 18S rRN

12、A作为标准控制并以引物SSU1 和SSU2扩增。 RT-PCR条件如下： 94C 5分钟，28个周期的94C 30秒，52C 30秒，72C 40秒，并延伸72C 5分钟。结果结果 GhWRKY3克隆和序列分析 在蛋白水平上鉴定和系统发育分析 GhWRKY3基因组序列分析 GhWRKY3 5侧翼区的部分公认的顺式作用元件的鉴定 GhWRKY3蛋白定位于细胞核 GhWRKY3 组织特异性表达和转录信号分子的影响 生物与非生物胁迫下GhWRKY3的表达谱GhWRKY3克隆和序列分析 根据植物WRKY基因的保守区域，设计引物WP1和WP2进行棉花WRKY基因保守区扩增，从棉花中分离一个约660 bp

13、的cDNA片段，然后根据内部获得的序列进行RACE-PCR技术1. 假定WRKY基因全长cDNA序列由1705个包含一个72 bp的5非翻译区（UTR）和一个109 bp的3UTR的核苷酸组成。2. 棉花假定WRKY基因的克隆与拟南芥AtWRKY3表现出高度的序列相似，所以新型棉花基因被指定为GhWRKY3。 3. GhWRKY3 的cDNA包含一个1524 bp编码507个与预测的分子量为55.1 kDa，等电点6.13的氨基酸残基的ORF。在蛋白水平上鉴定和系统发育分析与其他植物WRKY蛋白相比，假定的GhWRKY3蛋白分别和拟南芥，烟草，葡萄，辣椒中的WRKYs相似共有48.31%，55

14、.53%，54.33%和50.58%。根据WRKY结构域的数目及锌指结构的特点，WRKY家族被分为三组。推导的GhWRKY3被发现具有含高度保守的氨基酸序列WRKYGQR和两个假定的锌指基序（CX4CX2223HX1H）的两个WRKY结构域。此外，假定的GhWRKY3蛋白质序列在359362位置包含一个假定的核定位信号PKRR。研究GhWRKY3和其他WRKY蛋白之间的进化关系，通过MEGA4.1构建系统进化树。结果表明，这些可用的WRKY蛋白被分为三组，假定的GhWRKY3更密切相关于I组，成员包括NtWRKY3，AtWRKY4，VvWRKY2，NtWRKY2等等。上述数据表明，GhWRKY

15、3属于I组WRKY家族。GhWRKY3基因组序列分析通过GhWRKY3基因的基因组序列和cDNA序列比较发现有三个内含子分别为599bp，81bp，325 bp。所有三个内含子有高含量AT的典型特征和保守的5- GT和AG-3剪接位点。第三内含子被发现是一个位于结构域和插入位置为Ag和G之间的R型内含子。GhWRKY3，AtWRKY3和VvWRKY2的比较表明内含子的数目和位置的是保守的（图1）。AtWRKY3，VvWRKY2的第三个内含子也是R型内含子。所有这三个基因第三个内含子均位于C-末端WRKY结构域。这些结果表明，WRKY结构域的保守内含子的剪接位点可能在转录或在进化中起着重要的作用

16、。图1白-编码、黑-内含、灰-非编码黑-ATG、星-终止密码、白-所有R型内含子GhWRKY3 5侧翼区的部分公认的顺式作用元件的鉴定利用I-PCR和巢式PCR，从棉花基因组DNA中分离GhWRKY3基因的5侧翼区的一个720 bp的片段。然后，在5侧翼区使用PlantCARE数据库预测几个公认的顺式作用元件可能参与基因转录调控，包括（i）一个ABRE；（ii）两个TC重复序列；(iii) 一个GA基序，一个GT1基序，三个BOX4；（iv）一个GCN4基序，两个Skn-1基序。在这一区域也存在着基本的顺式作用元件TATA-box和CAAT-box。这些数据表明，GhWRKY3在植物应激反应和

17、生长发育中可能参与多种信号途径。GhWRKY3蛋白定位于细胞核通过PSORT程序，由于假定的NLS（PKRR）存在，我们预测GhWRKY3蛋白位于细胞核。为进一步确定GhWRKY3的亚细胞定位，构建了一个CaMV 35S启动子控制的GhWRKY3-GFP融合蛋白（图2A）。然后利用粒子轰击的方法分别将35S：GFP结构和35S：GhWRKY3-GFP控制子导入洋葱表皮细胞。通过荧光共聚焦激光扫描显微镜观察GFP荧光确定在洋葱表皮细胞的融合蛋白的位置，如图2B所示，洋葱表皮细胞携带35S：GhWRKY3-GFP荧光只在细胞核内，而在转染35SG：GFP的洋葱表皮细胞整个细胞质和细胞核中观察得到G

18、FP荧光。这些结果表明，GhWRKY3蛋白定位于细胞核中。GhWRKY3 组织特异性表达和转录信号分子的影响用半定量RT-PCR法进行探讨GhWRKY3基因的表达模式。图3a所示，在根，茎和叶中GhWRKY3的表达水平是相似的，这表明GhWRKY3组成型表达在根，茎和叶。探讨植物激素对GhWRKY3表达的影响，用五种植物激素，SA，ABA，ET，GA3和6-BA，还有两个类似物MeJA，NAA对棉花叶片进行处理，并在转录水平进行表达模式研究。结果表明，SA，ABA，MeJA，ET和GA3能提高GhWRKY3表达水平到不同程度。然而，6-BA和NAA对GhWRKY3表达没有显着影响（图3BH）。SA处理后，在6h时GhWRKY3表达增加，并24小时内维持在高水平。ET处理，GhWRKY3 mRNA在4小时内积累，同样在24小时内维持在高水平。茉莉酸甲酯和ABA都诱导GhWRKY3迅速表达并分别在4h和6h时达到最大水平。GhWRKY3 mRNA的积累增加在4h检测到，并在GA3处理后8h达到高峰。 H2O2的产生是一个关键的信号分子