生化实验技术与方法ppt课件

1、糖的薄层层析糖的薄层层析 v实验原理实验原理v薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。定量测定。v根据原理的不同薄层层析通常有根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。

2、电泳。实验操作实验操作硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。 1.2 g硅胶硅胶H加加4.0 ml0.5%CMC溶溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。在水平台上，自然晾干。2. 板的处理：板的处理：薄板的活化：薄板的活化：105，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地值相近的化合物也能清楚地分开。分开。3. 点样：样品为鼠李糖、木糖和葡

3、萄糖。点样量点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10l。留意：点样点的直径小于。留意：点样点的直径小于5mm，点样，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。要少量多次，吹风机风力不能过大。4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水水=12：3：3：2体积比），新鲜配制。体积比），新鲜配制。5. 显色：显色剂：苯胺显色：显色剂：苯胺-二苯胺二苯胺-磷酸试剂。磷酸试剂。20mm10mm30mm8mm苯丙氨酸解氨酶的提取纯化苯丙氨酸解氨酶的提取纯化 v实验原理实验原理v苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶L-phenylalanine：ammonia lya

4、se，简称，简称PAL；EC4.3.1.5是植物体内苯丙是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。中起重要作用。 v本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。仪器仪器高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统高速冷冻离心机；恒温水浴；电

5、子天平；柱层析系统试剂试剂酶提取液：酶提取液：0.1mol/L硼酸硼酸-硼砂缓冲液含硼砂缓冲液含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巯基乙醇）巯基乙醇）固体硫酸铵固体硫酸铵0.02mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液pH8.0，含，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，甘油，20mmol/L-巯基巯基乙醇）；乙醇）；DEAE纤维素纤维素52操作步骤操作步骤酶液提取酶液提取（1植物材料植物材料2g，剪成小段，加入，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。研钵研磨。（2将已匀浆的酶液转入离心管，将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心冷冻离心

6、30min。（3取离心后的上清液酶粗提取离心后的上清液酶粗提液），量出其体积，留样液），量出其体积，留样 0.5ml 。硫酸铵分级沉淀酶蛋白硫酸铵分级沉淀酶蛋白（1根据实际体积、温度和硫酸铵根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到饱和度用量表，算出达到38%饱饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（量，并称硫酸铵。（240g/L)（2将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于；然后于9000r离心离心15min，保留

7、上清液于烧杯内。保留上清液于烧杯内。（3根据硫酸铵饱和度用量表，算根据硫酸铵饱和度用量表，算出从出从38%到到75%饱和度所需硫酸饱和度所需硫酸铵用量。铵用量。 （222g/L)（4按上述按上述2步同法处理，离步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。心后，弃去上清液，保留沉淀。（5将沉淀溶于将沉淀溶于2ml酶抽提液中酶抽提液中,留留样样 0.5ml 。透析脱盐透析脱盐酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜析过夜,留样留样 0.5ml 。银杏叶银杏叶2g +10ml酶提取液研磨酶提取液研磨 4000rpm、30min 取上清液取上清液 加硫酸铵至饱和度加硫酸铵至

8、饱和度38% 9000rpm、15min 取上清液取上清液 加硫酸铵至饱和加硫酸铵至饱和度度75% 9000rpm、15min 取沉淀取沉淀 溶于溶于2ml酶抽提液酶抽提液 透析透析纯化纯化离子交换层析离子交换层析-DEAE纤维素纤维素（1称取称取DEAE纤维素纤维素52干粉干粉11.5g，加，加20ml的的0.02mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液pH8.0浸泡浸泡4h以上或浸泡过夜）。以上或浸泡过夜）。（2装柱：把预处理的装柱：把预处理的DEAE纤维素纤维素52装柱。装柱完成后，装柱。装柱完成后，用用23个床体积的个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液pH8.0洗脱平洗脱平衡

9、该柱。衡该柱。（3上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液23cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。厚液层。注意上样开始就收集流出液。（4洗柱：约用洗柱：约用2倍床体积的倍床体积的A液液0.02mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液及及B液含液含1mol/LNaCl 的的0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗柱，磷酸盐缓冲液洗柱， 按洗脱管编号，取按洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其值高的管中洗脱液测其PAL的活力；的活力；合并主要含有合并主要

10、含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积活力的各管洗脱液，并量出其体积ml）。）。苯丙氨酸解氨酶的活力测定苯丙氨酸解氨酶的活力测定 PAL催化催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若处有最大吸收值。若酶的加入量适当，酶的加入量适当，A290升高的速率可在升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定升高的速率以测定PAL活力。规定活力。规定1h内内A290增加增加0.01为为PAL的一个活力单位。的一个活力单位。v取试管取试管2支，按表中所述支，按表中所述0号为调零管，号

11、为调零管，1号为测定管。号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml） 试剂类型调零管（0号）待测管（1号）pH8.7的0.1mol/L硼酸缓冲液320.1mol/L L-苯丙氨酸溶液0 1样品（酶）溶液0.1 0.1将各管混匀，放入将各管混匀，放入40恒温水浴保温恒温水浴保温1h准确计时），到时准确计时），到时各加各加0.2 ml 2 mol/LHCl终止反应。终止反应。紫外分光光度于波长紫外分光光度于波长290nm处测定处测定1号管的号管的A290。蛋白质测定考马斯亮蓝染色法）蛋白质测定考马斯亮蓝染色法）取酶液取酶液0.1ml，用

12、蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至5ml取试管取试管8支，按下表加入各溶液：支，按下表加入各溶液：将上述各试管混匀，静置将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的，测定各管的A595。 试管编号01234567标准蛋白质溶液（ml）50ug/ml 00.20.40.60.81.0/稀释酶液（ml）/1.01.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.01.01.0考马斯亮蓝（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.0PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算总活力、比活力、蛋白质含量的计算步骤步骤体积（体积（ml）蛋白质含量蛋白质含量（mg）总活力总活力（m）比活力比活力（m/mg

13、protein）粗提粗提硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀透析透析离子交换层析离子交换层析SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE测定蛋白质测定蛋白质分子量分子量 v原理：原理：vSDS PAGE是最常用的定性分析蛋白质是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。和测定蛋白质分子量。v 电泳迁移率与颗粒的电荷、外形、大小电泳迁移率与颗粒的电荷、外形、大小分子量有关，如电荷、形状都一样，分子量有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。则电泳迁移率只与分子量有关。测定各条带的相对迁移率，测定各条带的相对迁移率，

14、根据已知蛋白质分子量和根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，对迁移率为横坐标，lgMr为纵坐标作标准曲线。根为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们率从标准曲线上查出它们的的lgMr，再换算成蛋白质，再换算成蛋白质分子量分子量操作如同操作如同PAGE。样品：蛋白质要完全变性。样品：蛋白质要完全变性。蛋白质蛋白质+SDS+巯基乙醇巯基乙醇 100 2-5分钟分钟标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白分子量以内。在标准蛋白分子量以内。染色：考马氏亮蓝、银染色

15、染色：考马氏亮蓝、银染色该法测定蛋白质分子量的局限性：该法测定蛋白质分子量的局限性：1.蛋白质是由亚基如血红蛋白或两条以上蛋白质是由亚基如血红蛋白或两条以上肽链如胰凝乳蛋白酶组成的，测定时只肽链如胰凝乳蛋白酶组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的是它们的亚基或单条肽链的MW。2. 电荷异常的蛋白质如组蛋白，带大量正电荷异常的蛋白质如组蛋白，带大量正电荷）电荷）3.结构异常，不于分子量呈线性关系如胶原结构异常，不于分子量呈线性关系如胶原蛋白）蛋白）4.带有较大辅基的蛋白质如糖蛋白）带有较大辅基的蛋白质如糖蛋白）实验操作实验操作编号溶液名称12%分离胶4%浓缩胶130% Acr 0.8% Bis

16、2.0ml0.2ml2pH 8.8 Tris -HCI1.25ml-3pH 6.8Tris- HCI-0.375ml410%SDS50ul15ul5TEMED5ul5ul610%AP50ul15ul7H2O1.65mlo.9ml总体积约5 mL约1.5 mL 胶的制备胶的制备标准蛋白质标准蛋白质分子量分子量兔磷酸化酶兔磷酸化酶B97 400牛血清白蛋白牛血清白蛋白66 200兔肌动蛋白兔肌动蛋白43 000牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶31 000胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂20 100鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶14 400样品的处理：按样品的处理：按0.5mg蛋白质蛋白质/1mL溶液的比例向标准蛋白质溶液的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液小试管），充分溶解后，置沸水或待测样品中加入样品溶解液小