肌苷对海人藻酸引起纹状体损伤的保护作用

1、    【关键词】  肌苷Protective effect of inosine on  intrastriatal kianic acid injection induced lesion in the rat【Abstract】   AIM:    To establish the animal model of intrastriatal kainic acid (KA) injection and to investigate the effect of systematic

2、 administration of inosine on the striatal lesion size and the number of NADPHd positive neurons in this model. METHODS:     KA was stereotaxically injected into the left striatum of rats.  Ten  rats were divided into 2 groups: Inosine group (n=5), receiving ip inosine

3、administration, (50 gL-1, 75 mgkg-1) , 3 times each day, from 1 day prior to operation to day 3 postoperatively when the rats were sacrificed, and control group (n=5), receiving normal saline instead of inosine. Nissl stain and NADPHd histochemistry were then performed to investigate the difference

4、of lesion size and NADPHd positive neurons between inosine and saline treated groups.  RESULTS:   Inosine decreased the size of  KAinduced striatal  lesion area and increased the number of NADPHd positive neurons.   CONCLUSION:   Inosine can attenuate KAi

5、nduced striatal lesion and show protective effect  on NADPHd positive neurons in the striatum. These findings provide a pontential clinical use of inosine in the CNS disease.【Keywords】 kainic acid;  inosine;  corpus striatum; NADPHd positive neuron【摘要】  目的：  建立大鼠纹状体内注射海人藻酸（K

6、A）模型，并观察肌苷对纹状体损伤面积及NADPH脱氢酶（NADPHd）阳性神经元数目的影响.  方法：  采用纹状体内注射KA制备模型. 10只大鼠分成2组（n=5），分别于手术前1 d给予肌苷或等量生理盐水（对照组），腹腔注射，每日3次，持续给药至手术后第3日结束，利用尼氏染色和NADPHd的组织化学方法，观察肌苷组和对照组纹状体损伤面积及NADPHd阳性神经元数目的差别.  结果：  肌苷可以使KA引起的纹状体损伤面积减小并增加NADPHd阳性神经元的数目.  结论：  肌苷可以减轻兴奋性毒素KA引起的纹状体损伤，并对纹状体内的N

7、ADPHd阳性神经元具有保护作用.【关键词】 红藻氨酸，肌苷，纹状体， NADPHd阳性神经元0引言肌苷在临床上被广泛地应用于各个领域，传统观点认为在中枢神经系统，肌苷是一种无活性的代谢中间产物，但是最近研究表明肌苷在体外可保护神经元免于损伤. 史明等1发现，在用ZnSO4损伤PC12（一种常用的神经元模型）后，单纯给予肌苷即可提高PC12细胞的存活. 由于兴奋性毒素的损伤是各种神经退行性疾患的一个重要的共同机制，因此，我们使用兴奋性毒素海人藻酸（KA）损伤纹状体模型2，探讨肌苷是否在体对兴奋性毒性引起的神经细胞损伤具有保护作用.1材料和方法1.1材料成年SD雄性大鼠10只(第四军医大学实验动

8、物中心提供)，体质量250300 g. 利用日本Narishiga公司立体定向仪制作纹状体内注射KA模型. 10只大鼠分成两组(n=5)，分别于术前1 d给予肌苷（50 gL-1, 75 mgKg-1）或等量生理盐水腹腔注射，每日3次. 持续给药至术后第3日结束.1.2方法1.2.1纹状体内注射KA模型动物用10 gL-1戊巴比妥钠50 mgKg-1，腹腔注射麻醉后，置于脑立体定位以上，常规皮肤消毒，正中矢状切开头皮，颅骨钻孔，依图谱在尾壳核前部（AP， 0.71.0 mm； LP， 3.0 mm；V， 4.0 mm） 5 min内用微量进样器徐缓注入1.0 gL-1的KA或生理盐水0.5 L

9、，并留针5 min后缓慢退出.1.2.2组织处理手术后，大鼠存活3 d，将动物麻醉，经左心灌注生理盐水100 mL，然后灌注0.1 molL-1 PBS配置的40 gL-1多聚甲醛350 mL. 1.5 h后取脑，并后固定3 h，再放入200 gL-1蔗糖平衡溶液中，置于4冰箱中过夜. 组织沉底后，于恒冷箱内切片，片厚40 m，分为5套.1.2.3组化染色和计数从5套切片中随即取出两套，分别作Nissl染色和NADPH脱氢酶(NADPHd)组化染色. NADPHd组化染色是将切片洗涤3次后，放入含NADPHd 1.0 gL-1,硝基四氮唑蓝（NBT）100 mgL-1和3 gL-1 Trito

10、n X100的10 mmolL-1的PBS(PH7.4)溶液中孵育1 h，染好后用10 mmolL-1的PBS中止反应3. Nissl染色中的5个等距切片（200 m）被用来衡量KA的损伤面积，其中两个位于针道平面以前，两个位于之后，一个恰好位于针道平面. 在BX60显微镜2倍目镜下采图，并于Photoshop6.0软件对其损伤区域进行描摹及计算. 同样，NADPHd组化染色中的5个等距切片（200 m）被用来衡量肌苷对纹状体NADPHd阳性细胞数目的影响，我们使用损伤侧占对照侧纹状体NADPHd阳性细胞数目的百分数比作为衡量存活的指标. 被检平面按照其距针道平面的距离依次为-400，-200

11、, 0, 200, 400 m （Tab 1）.统计学处理： 使用SPSS软件进行student t检验. 对于因方差不齐不能采用student t的数据，使用 Wilcoxon(秩和检验)统计方法对其进行分析.2结果2.1尼氏染色手术后3 d，KA损伤侧纹状体明显萎缩，侧脑室扩大. 损伤区较周围组织颜色浅淡，并与周围正常脑组织之间有一明显的分界线，易于区分. 且在损伤中央切片上占据了大部分纹状体，但皮质未被累及（Fig 1A）. 该区内大细胞神经元数目明显减少，但是胶质细胞增生明显. 肌苷组与生理盐水组相比，损伤区域更小一些（Fig 1B）. 定量分析证实肌苷组与生理盐水组比较，在被检的5个

12、层面，损伤面积均有不同程度的减小（Tab 1）.2.2NADPHd组化染色KA损伤后，纹状体中心NADPHd神经元完全消失, NADPHd阳性神经纤维密度显著减低. NADPHd阳性神经元的减少和NADPHd阳性纤维密度减低，从损伤区中心至边缘呈渐变趋势. 损伤区周缘残存的NADPHd阳性神经元, 形态较单一, 梭形者居多, 胞体较小, 神经纤维不连贯，断断续续，突起较少而短，NADPHd阳性纤维密度也较低. 肌苷组与对照组相比，损伤区形态未见区别，但损伤区周缘残存细胞比例更高一些（Fig 2），在所检验的5个平面，残存细胞与对侧细胞数目的比值均有不同程度的提高（Tab 1）.图1尼氏染色Fi

13、g 1Nissl staining(略)图2NADPH脱氢酶阳性神经元(略)表1肌苷对KA引起的大鼠损伤面积及NADPHd阳性神经元数目的影响(略)3讨论通过本实验，我们证明了肌苷对KA局部注射引起的纹状体损伤有保护作用. 在以前的实验中，肌苷被直接注射入CNS神经元的胞体处以促进其侧枝出芽4. 但是在本实验中我们探讨了腹腔注射肌苷对CNS保护的可能性. 这是因为，肌苷分子质量很小（268.3 ku）,易于透过血脑屏障5. 而在KA损伤后，血脑屏障也失去其完整性6，因此，外周给予肌苷即可能可以对抗KA的毒性作用. 我们的实验证实了这一点.- 28 焦灵利，倪孟祥，陈日，等. 头孢唑林钠联合舒巴坦钠对产酶和非产酶菌的体内抗菌活性J. 中国药师，2000,3(5):26629 Gavalda J, Torres C, Tenorio C, et al. Efficacy of ampicillin plus ceftriaxone in treatment of expeimental endocarditis due to Enterococcus faec