膜色谱技术在生物大分子分离与纯化中的应用

1、第21卷第5期2001年10月膜科学与技术MEMBRAN E SCIENCE AND TECHNOLO GY Vo1. 21No. 5Oct. 2001文章编号:1007-8924(2001 05-0066-07膜色谱技术在生物大分子分离与纯化中的应用陈灏陈欢林3(浙江大学材料与化工学院摘要:, 具有选择性高、分离速度快、能耗低. 本文论述, 并介绍了亲和、疏水、离子交换、多级等四种膜色谱在.关键词; 蛋白质纯化; 亲和分离; 离子交换; 疏水作用中图分类号:TQ028. 8文献标识码:A近十年来, 随着生命科学、生物技术和制药工业的迅速发展, 对于多肽、蛋白质、酶等活性生物大分子的分离与纯化

2、要求日益提高. 这类分子通常来自天然产物或发酵液中, 其初始浓度一般较低, 而且对温度、p H 值、剪切力、有机溶剂等非常敏感, 易于失活或降解. 对于这类分子的高效分离与提纯, 是生物工程下游技术的关键性问题之一.传统的液相色谱所用吸附介质多为颗粒状吸附剂, 其存在以下四个方面的问题:介质刚性不够、易被压缩, 难以获得较高的处理速度, 也不易进行线性放大; 床层内易产生沟流, 传质效果较差; 配基价格昂贵却不能充分利用, 只有1%2%的配基能确实与蛋白质结合1; 吸附柱易堵塞和污染, 往往只适用于间歇操作, 处理量相对较低, 操作时间较长.另一方面, 传统的膜分离技术虽然有分离速度快、操作压

3、力低、无相变、能耗低、易于放大和连续操作、基质来源广泛且价格相对较低等优点, 但由于其靠筛分机理分离, 对目标产物与杂质大小相近的混合物分离显得无能为力2.膜色谱技术是液相色谱和膜分离相结合的一种新技术, 融合了二者之长, 具有快速、高效、高选择性、易于放大等特点, 能满足生物大分子高效分离与纯化的需要, 在生物大分子的分离与纯化中已日益受到人们的重视, 必将得到广泛的应用.收稿日期:2000-10-08; 修改稿收到日期:2000-12-04基金项目:国家自然科学基金资助项目(29676038 作者简介:陈灏(1977 , 男, 辽宁省沈阳市人, 硕士生, 研究方向:生物化工. 3通讯联系人

4、1膜色谱的原理和特点根据配基与目标蛋白的相互作用方式, 膜色谱可分为四类:亲和膜色谱(Affinity Membrane Chro 2matography , AMC , 离子交换膜色谱(Ion -ex 2change Membrane Chromatography , IMC , 疏水作用膜色谱(Hydrophobic Interaction Membrane Chro 2matography , HIMC , 多级膜色谱(Multistage Mem 2brane Chromatography , MMC .膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质, 连接配基, 利用膜配基与蛋白质之间的相互作用

5、进行分离纯化. 当料液以一定流速流过膜的时候, 目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合, 而杂质则透过膜孔流出, 待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来, 其纯化倍数可达数百乃至上千倍.膜色谱是目前生物大分子分离中最为有效的方法之一, 其特点为:(1 色谱填料柱中的每一片膜都相当于一个短而粗的吸附床层, 膜厚相当于床层高度, 当床层体积一定时, 这种结构有利于在相同压降下获得更高的流速, 从而提高了分离速度和处理量;(2 膜表面的配基与液流主体间的扩散路径很短, 膜介质只受表面液膜扩散及吸附动力学的影响3, 消除了传统色谱中占主要地位的孔扩散阻第5期陈灏等:膜色谱技术在生物大分子分离与

6、纯化中的应用67力, 大大改善了传质效果, 提高了配基的利用率和总的分离速度, 缩短了分离时间, 一次循环操作时间一般只是普通填料柱的十分之一, 提高了生产效率, 并有利于保持配基和目标蛋白的生物活性;(3 采用了膜介质, 整个床层的压降大为降低, 一般只用低压蠕动泵即可满足分离要求, 这样既降低了设备投资和运行费用, 也避免了液流与泵体直接接触, 便于无菌操作和防止蛋白质失活;(4 当, , (5 , 压力, .目前, 关于膜色谱的机理、数学模型及其与HPLC 等方法比较的报道逐渐增加4. 模型中考虑的因素主要有对流、扩散、吸附、脱附等, 进一步的研究表明, 孔隙率、膜厚、轴向扩散、配基密度

7、等对分离效果也有很大影响. 对于吸附阶段, 可以采用Lang 2muir 单层或多层模型进行近似计算, 效果较好.良的成膜性能及良好的机械和热稳定性, 经活化处理后其性质变化也不大, 非常适合作为膜介质. 聚砜膜活化后可偶联三嗪染料或金属离子等配基. 尼龙微孔膜孔径分布较窄且机械稳定性较好, 但存在非特异性吸附, . 对尼龙膜进行酸水解后, , 并使其具有, , 可减7,86.-丙烯酸接枝共聚物、聚醚砜(PES -聚乙烯氧化物(PEO -羟基乙基纤维素(HEC 等, 若以一定孔径的惰性基质为底膜, 在其上覆盖这类共聚物膜, 可作为配基的支撑膜. Char 2cosset 等9研制了PES -P

8、EO -HEC 复合膜, 此种膜以PES 和PEO 的混合物为骨架以增加物理强度, 膜的外表面则共价连接HEC , 以增加亲水性基团并便于配基的偶联, 其对蛋白质非特异性吸附很小. Tennikova 等10在GMA -EDMA (甲基丙烯酸缩甘油基酯-乙烯基二甲基丙烯酸酯 共聚膜上进行寡聚GMA 的接枝改性, 增加了原来膜的机械强度, 并减少了膜的非特异性吸附. Suto 等11以HCl 为催化剂、戊二醛为交联剂、醋酸为溶剂, 制备了壳聚糖-羟丙基纤维素交联膜.近几年来, Zusman 12研究的 凝胶玻璃纤维(GF G 受到越来越多的重视, 这种新型材料由于对蛋白质的非特异性吸附较小, 非

9、常适于作为亲和膜色谱的基质, 它在室温干燥的条件下可保存几个月.2膜色谱介质材料膜介质的选择是影响膜色谱分离效果的重要因素之一, 理想的膜介质具有以下的性质:有大量适当大小的孔及较窄的孔径分布, 以便偶联尽可能多的配基, 并为配基与目标蛋白的相互作用提供场所; 对杂蛋白等的吸附应尽可能小, 以提高产品纯度; 膜介质上应具有羟基、环氧基等可活化的基团, 以便与配基进行偶合; 具有一定的物理与化学稳定性, 能承受液流穿过膜孔时的剪切力, 可进行反复的吸附、洗脱、再生、灭菌过程; 所选膜材料还应易于成膜, 且来源广泛、成本较低.目前, 常用作膜色谱介质的材料可分为天然高分子材料、人工合成高分子材料、

10、复合膜等三类.天然高分子材料有纤维素、壳聚糖等, 这些材料与配基的结合较为方便, 且具有较好的化学稳定性. Guo 等5研制了一种改性纤维素膜作为亲和膜色谱的基质, 其孔隙率更高、孔径更大(12m , 但结构均一性较差. 为加强机械和化学稳定性, 可在偶联配基前先交联环氧氯丙烷6. 甲壳素/壳聚糖及衍生物形成的多孔膜, 可采用有机硅、过渡金属、酶对其进行改性, 改性后可制成特殊功能膜材料. 脱乙酰度会影响壳聚糖类膜的酸稳定性和热、机械性能.人工合成高分子材料如聚砜、聚酰胺等, 具有优3膜色谱的制备尽管以膜为基质的膜色谱有多种形式, 但其制备过程差别不大, 为此本文以亲和膜色谱的制备为例进行介绍

11、, 其过程也可供其它膜色谱制备参考.在膜材料选定以后, 常采用以下两种路线制备成膜色谱柱:(1 膜材料成膜活化配基偶联, 这条路线主要是利用现有的商品膜, 通过对其进行偶联改性来获得所需膜色谱柱;(2 膜材料活化配基偶联成膜, 这条路线是从最简单的膜材料入手, 先制备功能化的膜材料, 再使之成膜.配基一般是指能够与目标产物进行可逆的和特异性结合的分子或基团, 按其来源可分为天然配基(凝集素、肝素、核苷酸、蛋白A 、蛋白G 等 和人工68膜科学与技术第21卷合成配基(活性染料、过渡金属离子、人工合成肽段、烷基等 两类. 天然配基的性能优于人工合成配基, 但其制取和提纯较困难, 价格昂贵且使用条件

12、苛刻, 故实际应用中应结合分离目标慎重考虑. 按作用对象, 配基又可分为特异性配基和通用性配基. 特异性配基能够与目标分子高度特异性结合, 基本上是一一对应的关系, 如单克隆抗体-抗原间的结合, 这类配基较为昂贵且不易保持稳定性; 通用性配基则能凝集素-糖蛋白间的结合., 亲和介质. , 一种是先将普通载体的表面进行活化, 再将配基偶联上去; 另一种方法则是先将配基偶联到载体原料上, 再利用偶联后的原料制备亲和载体. 一般来说, 前一种方法(先活化再偶联 配基用量较少、利用率较高, 故应用较广. 关于配基偶联方法的报道有很多4,8, 大多是在HPLC 、亲和层析等方法的基础上发展起来的, 较为

13、常用的有溴化氰法、环氧乙烷法、三嗪法、羰基二咪唑活化法、高碘酸盐氧化法、硼氢化钠还原法、磺酰氯法、碳二亚胺法、混合酸酐法和氟甲基吡啶盐法等, 其中, 前四种方法目前应用最为普遍和有效. 对于金属离子螯合膜色谱则还需在配体上螯合金属离子13. 在分离中金属离子起桥梁作用, 一侧与载体膜相连, 另一侧与生物分子配位结合. 在两侧的结合过程中, 配位键都起到了一定作用. 在螯合金属离子时, 注意金属离子的配位点既要保证能与螯合剂形成稳定的化合物, 又要保证有剩余的位点留给生物配体. 这种方法制得的配体稳定, 蛋白质吸附量大, 吸-脱附条件温和, 成本低, 但要注意金属离子的泄漏问题.配基可以直接固定

14、在载体上, 但是由于采用这种方法偶联的配基与目标分子的结合存在着一定的空间位阻, 故偶联后配基与目标分子的结合常数一般要降低数倍至数十倍. 这种变化对结合力较弱的亲和体系有非常大的影响. 为消除这种现象, 可在配基与载体之间引入间隔臂(spacer , 以增加配基与载体之间的距离, 减少空间位阻的影响. 通常, 配基与载体之间应插入46个亚甲基桥14. 如果配基本身是直链大分子, 或亲和分离的目标物质为生物小分子, 则可以不使用间隔臂7. 也有研究者认为, 采用亲水性强的间隔臂能极大地降低非生物特异性吸附作用.4膜色谱的应用411亲和膜色谱(AMC蛋白质亲和分离中常用的作用体系有抗原-单克隆抗

15、体, 激素-受体蛋白, 核酸-核酸结合蛋白, 酶-底物/抑制剂/辅酶, -蛋白A/G , -/采用低温氧或氨等离子体法烯中空纤维微孔膜, 使膜表面产生了-OH 、-COOH 和C =O 等极性基团, 制备了Fe 3+、Ni 2+、Cu 2+、Zn 2+等金属离子螯合亲和膜, 用于溶菌酶的分离, 结果表明,Ni 2+、Cu 2+螯合膜对溶菌酶有较高的吸附量, 在20min 和68W 的最佳条件下, 制成的Cu 2+膜对溶菌酶的平衡吸附量为8g/cm 2. 螯合过程中采用氯化物盐溶液制得的膜比采用硫酸盐溶液制得的膜平衡吸附量要高. 吸-脱附量衰减的问题可采用补充螯合离子的方法解决.Hagedorn

16、 等15以GMA -EDMA 为基质, 偶联免疫球蛋白抗体, 可以快速(<5min 分析蛋白G.Platonova 等16以特制的肽段为配基, 经环氧基团活化, 将配基的氨基端偶联在GMA -EDMA 基质膜上, 获得了免疫亲和膜介质. 这种介质用与抗原结合位点结构相同的肽段代替了传统的蛋白配基(抗原 , 成本大为降低, 可以有效地从血清中鉴定和分离免疫球蛋白抗体. 所用十五肽和十六肽配基的饱和吸附量可达0142mg/mL 和1. 50mg/mL.Zeng 等17以大孔甲壳素膜作为膜基质, 分离小麦细菌凝集素, 这种基质机械性能和通透性较好, 而且由于膜表面有大量的N -乙酰基-D -氨

17、基葡萄糖残基, 故无须进一步修饰即可用于蛋白质纯化, 最终产品的纯度(>99% 和产量(50mg/100g 均较高. 他们还以对氨基苯( PAB 为配基, 分离胰岛素及类胰岛素酶(尿激酶、血浆酶原活化剂、丝氨酸蛋白酶等 18.PAB 是一种胰岛素抑制剂, 其成本大大低于其它抑制剂. 利用琥珀酸作为连接臂, 将PAB 偶联到甲壳素膜上, 可获得较高的配基密度(217mmol/g , 对胰岛素的最大吸附容量可达(7814±412 mg/g.Amatschek 等19以聚甲基丙烯酸酯膜为基质, 及能与因子特异性结合的人工合成肽段为配基, 来分离因子. 为了寻找相应的肽段序列, 他们采

18、用了双重定位扫描策略, 从近5000种可能序列中找第5期陈灏等:膜色谱技术在生物大分子分离与纯化中的应用69到了一种匹配序列, 并以此合成了作为配基的肽段.Zusman 12以凝胶玻璃纤维膜为基质, 包埋p53-Ig G 配基, 从结肠癌病人的血清中分离p53抗原,柱进行了比较, 充分证明了HIMC 的高效性. 另外,他们还利用苯基HIMC 对牛肝过氧化氢酶(BLC 进行了分离, 使得产品比活性比粗品提高了1118倍, 回收率接近100%.29, 、甲基、戊烷, 40mol/g , 以十二烷基甲基丙烯酸酯-EDMA 共聚物(体积比153550 为基质, 经011mL/L 磺酸在80条件下处理5

19、h , 获得了疏水膜介质, 用于分离肌球素、核酸酶、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶. 由于采用了梯度洗脱, 减少了分离时间和移动相的用量, 从而降低了分离过程的成本, 特别适用于制备级酶的分离, 表2列出了近几年来应用研究较为成功的一些疏水膜色谱体系.表2疏水膜色谱的应用研究实例目标蛋白牛肝过氧化氢酶牛血清白蛋白热原膜介质纤维素膜纤维素膜纤维素膜配基苯基苯基己二胺文献282929303132分离出的蛋白质浓度达到5mg/mL , 是近年来肿瘤相关抗原(TAA 分离的较高水平.Castilho 等20在尼龙微孔膜表面交联葡聚糖(M r 6000和40000 和聚乙烯醇(M r 72000 , 获得了具有足

20、够活化位点和较低的蛋白质非特异性吸附的膜基质, . 上偶联蛋白A Ig G. , , 而且对蛋白质, 在交联亲水性的葡聚糖和PVA 后, 膜性能有了较大提高, 表1为近年来研究较为成功的一些实例.表1亲和膜色谱的应用研究实例目标蛋白胰岛素TAA免疫球蛋白抗体小麦细菌凝集素因子人IgG 溶菌酶人IgG 人IgG (从血浆或血清中 过氧化氢酶内毒素膜基质甲壳素GFGGMA -EDMA 共聚物配基PABp53-IgG 肽段甲壳素残基人工肽段文献41216171920甲壳素聚甲基丙烯酸酯尼龙-葡聚糖-蛋白APVA聚丙烯微孔膜改性聚己内酰胺聚二乙烯醇纤维素复合膜尼龙66Ni2+2+十二烷基甲基丙肌球素、

21、核酸酶、溶菌烯酸酯-GMA -十二烷基酶和胰凝乳蛋白酶EDMA 共聚物牛血清白蛋白人肿瘤坏死因子聚乙烯膜Quick Disk苯基丁基、苯基21,22、Cu重组蛋白A/G 23L -组氨酸242526413离子交换膜色谱(IMC离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的离子交换作用进行分离的. 根据离子交换基团的性质, 可分为强阳离子型、弱阳离子型 、强阴离子型、弱阴离子型. 由商用膜改性制得的膜介质, 其成本相对较低5. 在流速较慢的情况下, IMC 还可通过梯度洗脱分离蛋白质的混合物. 离子交换膜色谱由于操作条件较温和, 可以有效地保持蛋白质的活性, 并可延长膜的使用寿

22、命, 其缺点是选择性较差.Podgornik 等33等进行了IMC 纯化质粒DNA 和肽链等生物分子的研究, 还比较了不同洗脱方式下的分离效果. 采用GMA -DEMA 为基质, 二乙氨乙基(DEAE 为离子交换基团, 在5mL/min 的流速下有效地分离了四种寡聚核苷酸(长度分别为8, 10,12和14个核苷酸 . 还在同样的基质接上-SO 3-基团后, 用于肽链的分离.螯合铜离子组氨酸412疏水膜色谱(HIMC由于疏水配基结构简单, 通用性好且成本较低, 故疏水色谱已成为蛋白质分离纯化的常用技术之一. 但是, 目前常用的疏水色谱大多采用琼脂糖凝胶、葡聚糖等“软”基质, 分离速度不够理想,

23、且不易放大, 疏水膜色谱就是在此基础上发展起来的.疏水膜色谱上的配基, 常用的有甲基、丁基、苯基、辛基、己二胺、聚乙二醇等, 通过目标物质与这些配基之间疏水作用的不同而实现分离. 影响疏水膜色谱操作情况的主要因素有:盐离子的种类, 离子强度,p H 和柱温等27.杨利等28以纤维素膜为介质, 辛基为配基, 分离牛血清白蛋白(BSA , 并将实验结果与传统凝胶70膜科学与技术第21卷Dosio 等34利用阳离子IMC 从免疫毒素中分离出了未反应的单克隆抗体. 与羟磷灰石HPLC 相比, 虽然分离纯度差不多, 但分离步骤却大为简化. 尽管染料亲和层析也广泛用于免疫毒素的分离, 但是染料配基与核糖体

24、抑活蛋白(RIP 之间的相互作用不够稳定, 而且受离子强度和p H 的影响较大. 另外, 至少对-丝林霉素和灭叠球菌素来说, 亲和结合并不完全(65%90% . 因此, 在内毒素的分离中, 采用IMC 更为理想.Sasagawa 等35膜, 酸钠接入, , 制成离子交换膜介质, , 膜的蛋白质平衡容量可达到0142g/g , 以NaHCO 3-NaOH 缓冲液为洗脱液, 在p H 为910时洗脱率达到100%.由于膜上螯合了Mg 2+, 使得膜的透过速率也有较大增加.杨利等29以QAE 型IMC 分离纯化人尿激肽释放酶, 由于采用了径向色谱技术, 省去了传统的盐析和高速冷冻离心等步骤, 大大节

25、省了时间.Sun 等36采用纤维素膜共价连接DEAE 的径向IMC , 从血浆的分离物(Nitschmann fraction 中分离人凝血酶原, 样品的通过速率为2030mL/min , 在不降低分离效率的前提下, 洗脱速率达到40mL/min. 这种膜还可用于DNA 、多肽和其它蛋白质的分离.Zeng 等37在甲壳素膜上偶联乙烯基乙二醇二缩水甘油醚(EG DE , 获得了非常稳定的离子交换膜, 可在酸或碱溶液中保持强度. 他们采用三种低p I 值的蛋白质(卵白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素抑制剂 和两种高p I 的蛋白质(溶菌酶、细胞色素C 作为目标蛋白, 分离两组中任意两对蛋白质的混合物,

26、获得了很高纯度的产物(>99% . 这种膜非常适于从重组蛋白质中分离带有较高负电荷的内毒素和核酸等物质. 表3为近几年来应用研究较为成功的一些IMC 例子. 414多级膜色谱(MMC为了获得更高的纯化效果, 近年来还出现了多级膜色谱, 即将不同类型的膜介质组合在一起形成新的色谱柱进行分离. 这里的技术关键是根据目标产物选择适当的膜介质排列顺序和缓冲液条件, 以便使上一层洗脱下来的目标蛋白能够被下一层吸附. 如果安排合理, 多级膜色谱可以大大缩短混合产品的分离时间, 有效地节省设备投资, 表4为近几年来多级膜色谱的几个应用研究实例.表3离子交换膜色谱的应用研究实例目标分子人尿激肽释放酶人肿

27、瘤坏死因子膜介质纤维素膜GMA配基N (CH 3 3SO 3H -MgDEAE EG DE文献29323334353637、人血清白蛋白、胰岛素抑甲壳素膜制剂BSA乳清蛋白交联改性纤维素交联改性纤维素磺酸基38磺酸基、季胺基39表4多级膜色谱的应用研究实例目标蛋白甲酸脱氢酶膜介质Sartobind 膜(S ,Q ,Red 作用种类1. 阳离子交换2. 亲和作用3. 阴离子交换文献40BSA ,IgG改性纤维素和合1. 阳离子交换成共聚物2. 阴离子交换41414142改性纤维素和合1. 阴离子交换重组抗栓酶成共聚物2. 亲和作用尿激酶纤维素-丙烯酸1. 阳离子交换复合膜2. 亲和作用1. 亲和

28、作用2. 阴离子交换重组抗栓酶Sartobind 膜5展望现代生物工程技术的发展对生物大分子的分离与纯化提出了越来越高的要求, 目前的发展趋势是开发集成化的新型分离技术. 膜色谱作为一种新型的生化分离方法, 虽然尚未广泛应用于工业化生产, 而且缺少理论模型和大量实验数据的支持, 但是, 相信随着制膜技术、配基偶联技术、自动化控制技术的发展, 膜色谱分离技术在生物大分子的分离纯化过程中必将发挥越来越大的作用. 致谢:浙江大学生物工程研究所甘宏宇博士后对部分内容提出了修改意见, 在此表示感谢.参考文献1Dong G Q. Application of Eudragit S100in protein

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