腺病毒介导MnSOD基因转染对香烟烟雾提取物致内皮细胞氧化损

1、基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(20050533023通讯作者:陈平, E 2mail:chenp ing101hotm ail . com论著腺病毒介导MnS OD 基因转染对香烟烟雾提取物致内皮细胞氧化损伤及凋亡的影响曹蔚陈平蔡珊张程陈剑波吴杰中南大学湘雅二医院呼吸内科(湖南长沙410011【摘要】目的探讨香烟烟雾提取物(CSE 对内皮细胞氧化损伤及凋亡的影响, 腺病毒介导锰超氧化物岐化酶(MnS OD 基因转染内皮细胞后, 能否部分抑制CSE 致内皮细胞的氧化损伤及凋亡。方法体外培养人脐静脉内皮细胞株(ECV304 , 质粒转染MnS OD 基因后将内皮细胞分为3组:对照组、空

2、质粒组及MnS OD 组, 同时分别给予0%、5%及10%CSE 刺激。CSE 浓度刺激后的培养上清液和细胞爬片, T BA 法检测上清丙二醛(MDA 浓度, L 结果(1 CSE 刺激对照组内皮细胞, 可致MDA , 性。(2 与空质粒组比较, CSE 刺激后, P <0105 。结论(1 CSE (基因可以部分抑制香烟。【关键词】; 内皮细胞; 氧化应激; 凋亡Effect of adenov i rus 2m ed i a ted M nS OD gene tran sfecti on on ox i da ti ve i n jury and apoptosis of endot

3、heli a l cells i n duced by c i garette s m ok i n g extract CAO W ei, CHEN Ping, CA I Shan, ZHAN G Cheng, CHEN J ian 2bo, WU J ie . D epart m ent of Respiratory M edicine, The Second X iangya Hospital, Central South U niversity . Changsha, Hu nan, 410011, ChinaCorresponding author :CHEN Ping, E 2m

4、ail:chenping 101hot m ail . co m【Abstract 】O bjecti ve To elucidate the effect of cigarette s moking extract (CSE on oxidativeinjury and apop t osis of endothelial cells and the i m pacts of adenovirus 2mediated M nS OD transfecti on . M ethods The endothelial cells (EC V304 cultured in vitr o were

5、divided int o the contr ol gr oup, blank p las m id gr oup and MnS OD gr oup after transfecti on .The cells were harvested and supernatants werecollected after interfered by different concentrati ons of CSE f or 24h . T BA assay was e mp l oyed t o measure the concentrati ons of mal ondialdehyde (MD

6、A and T UNE L assay was conducted t o measure A I . Results A. CSE induced dose 2dependent and ti m e 2dependent incre ments of MDA and apop t osis of the endothelial cells in the contr ol gr oup (P <0105 . B. CSE induced dose 2dependent incre ments ofMDA and apop t osis of the endothelial cells

7、were reduced signticantly in MnS OD gr oup (P <0105 . Conclusi on CSE can induce oxidative injury and apop t osis of endothelial cells which could be partly inhibited by transfecti on of adenovirus 2mediated MnS OD.【Key words 】Cigarette s moking extract; Endothelial cell; Oxidative stress; Apop t

8、 osis慢性阻塞性肺疾病(COP D 是呼吸系统的常见病和多发病, 患病率和病死率均高1。吸烟被认为是COP D 的最主要致病因素2。香烟介导的氧化应激在COP D 的发病中起着不可忽视的作用3。本研究通过香烟烟雾提取物(CSE 直接刺激内皮细胞,观察内皮细胞氧化损伤和凋亡的变化, 以及腺病毒介导MnS OD 基因转染对CSE 致内皮细胞氧化损伤和凋亡的影响, 探讨内皮细胞氧化损伤及凋亡在吸烟致肺部疾病中的作用。材料与方法一、CSE 的制备按照Yunchao 等4的方法, 1支去过滤嘴燃烧634 的香烟由负压吸引器连续抽吸, 吸入的烟雾经出口通入20mL P BS 液中形成悬液, 悬液用Na

9、 OH 调至pH 714, 经微孔过滤膜过滤形成原液, 配置好的原液于1h 内用于实验, 用无血清培养液稀释成不同浓度, 公式为:CSE 浓度=CSE 原液体积/总体积×100%。分别配制成5%和10%的CSE 用于实验。二、细胞培养方法人脐静脉内皮细胞株(ECV304 购自中南大学湘雅医学院中心实验室。细胞培养置于完全培养基中, 于培养箱中培养。0125%的胰酶消化传代。三、细胞内基因转染11腺病毒介导的LacZ 转染率的测定(1 采用瞬时法将腺病毒介导的LacZ 转入细胞内5。取无菌6孔培养板, 每孔均放一无菌盖玻片, 0125%于完全培养基中, 1×104, (2 5

10、0%70%, 用1640洗涤3次, 分别加入0, 30, 50及70感染倍数(MO I 的Ad 2LacZ 后无血清培养基培养。(3 24h 后弃上清液, P BS 冲洗3m in ×3次, 4%多聚甲醛室温固定30m in, 再用P BS 冲洗3m in ×3次, 加入X 2gal 染色, 于37水浴箱3h 。(4 荧光显微镜下每盖玻片随机取5个视野计数黄绿色荧光细胞数, 同一视野白光下计数细胞总数, 转染率=黄绿色荧光细胞数/光镜下细胞总数×100%。21腺病毒介导的MnS OD 基因转染:步骤同上,待细胞融合50%70%, 用不含血清的1640洗涤3次, 加

11、入70MO I 的Ad 2MnS OD 后无血清培养基培养24h, 将MnS OD 基因导入ECV304, 再按不同目的进行相应后续实验。四、实验设计及分组将内皮细胞分为3组:(1 对照组; (2 空质粒组:转染70MO I Ad 2LacZ 的ECV304; (3 MnS OD 组:转染70MO I Ad 2MnS OD 的ECV304, 分别予以0%、5%及10%CSE 刺激, 收集三组细胞CSE 刺激24h 后, 以及对照组CSE 刺激前和刺激后6及12h的培养上清及细胞爬片, 每种处理因素收集6个标本。五、MDA 的检测分别将培养上清液加入试管中, 并设立标准管、标准空白管、测定空白管

12、, 95水浴40m in, 冷却后3500r/min, 离心10m in, 取上清液1mL, 532nm处, 测定各管吸光度值。T BA 法检测MDA:MDA (n mol/L =(测定管-测定空白吸光度 /(标准管-标准空白吸光度 ×标准品浓度(10nmol/L ×样本稀释倍数。六、凋亡率的检测细胞爬片用P BS 洗片, 4%的多聚甲醛室温固定30m in 。P BS 洗片, 内源性过氧化物酶阻断室温孵育30m in 。P BS 洗片, 通透液冰浴孵育2m in 。P BS 洗片, T UNEL 混合液37孵育60m in 。P BS 洗片, 荧光显微镜下分析结果。P B

13、S 洗片, 加入转化剂P OD 3730m in, P BS 洗片, 加入DAB 底物室温1030m in, 洗片封片, 。结果分析:5, T , 。凋亡I /×七、统计学处理数据用SPSS1310统计软件包进行统计分析处理, 数据以x -±s 表示, 进行方差齐性检验, 在方差齐性基础上, 组间多样本均数比较采用F 检验, 两两比较采用LS D 2t 检验, 检验水准=0105, P <0105为差异有统计学意义。结果一、腺病毒介导的LacZ 转染率结果表明:0, 30, 50和70MO I 的Ad 2LacZ 转染ECV30424h 后, X 2gal 染色后显微

14、镜下测得转染率分别为0、(512±213 %、(5913±312 %和(9313±219 %, 以70MO I 最明显(P <0105 , 见图1和2。70MO IAd 2LacZ 能进入90%以上的细胞内, 符合要求, 故取该浓度用于实验。二、CSE 刺激对照组MDA 及A I 的比较11CSE 刺激对照组24h 后MDA 及A I 的变化:如表1、图3和4所示, CSE 刺激对照组细胞24h 后, 5%CSE 组较0%CSE 组MDA 和A I 均升高, 有统计学意义(P <0105 。10%CSE 组较5%CSE 组MDA 和A I 均升高, 有

15、统计学意义(P <0105 。表1CSE 刺激对照组24h 后MDA 及A I 的变化(x -±s CSE 浓度MDA (nmol/L A I (% 0%CSE 01115±01015410±0185%CSE 01406±01010#615±019#10%CSE11100±01016#915±110#注:#与同组内相邻前一浓度比较, P <0105734 2110%CSE 刺激对照组不同时间MDA 及A I 的变化:如表2、图3和图4所示, 10%CSE 刺激对照组细胞, 6h 后的MDA 较刺激前升高, 有统计

16、学意义(P <0105 , 而6h 后的A I 较刺激前差异无统计学意义(P >0105 。12h 的MDA 和A I 较6h 均升高, 有统计学意义(P <0105 。24h 的MDA 和A I 较12h 均升高, 有统计学意义(P <0105 。表210%CSE 刺激对照组不同时间MDA 及A I 的变化(x -±s 时期MDA (n mol/L A I (% 刺激前01020±01012118±0166h 01261±010213213±01912h 01500±010233615±016324

17、h11100±0101635±1103注:3<01三、实验组之间MDA 和A I 的比较11CSE 刺激24h 后实验组之间MDA 的比较:如表3所示, 0%CSE 刺激24h, 空质粒组与对照组、MnS OD 组与空质粒组MDA 比较差异均无统计学意义(P >0105 ; 5%CSE 刺激24h, 空质粒组与对照组比较差异无统计学意义(P >0105 ,MnS OD 组较空质粒组降低, 差异有统计学意义(P <0105 ; 10%CSE 刺激24h, 空质粒组与对照组比较差异无统计学意义(P >0105 , MnS OD 组较空质粒组降低,

18、差异有统计学意义(P <0105 。表3CSE 刺激24h 后实验组之间MDA 的比较(n mol/L,x -±s CSE 浓度对照组空质粒组MnS OD 组0%CSE 01115±0101501117±0101101123±010155%CSE 01406±01010#01417±01017#01227±01022#10%CSE 11100±01016#11107±01022#01502±01025#注:与空质粒组比较, P <0105; #与同组内相邻前一浓度比较,P <0

19、10521CSE 刺激24h 后实验组之间A I 的比较:如表4所示, 0%CSE 刺激24h, 空质粒组与对照组、MnS OD 组与空质粒组A I 比较差异均无统计学意义(P >0105 ; 5%CSE 刺激24h, 空质粒组与对照组比较差异无统计学意义(P >0105 ,MnS OD 组较空质粒组降低, 差异有统计学意义(P <0105 ; 10%CSE 刺激24h, 空质粒组与对照组比较差异无统计学意义(P >0105 , MnS OD 组较空质粒组降低, 差异有统计学意义(P <0105 。表4CSE 刺激24h 后实验组之间A I 的比较(%, x -&

20、#177;s CSE 浓度对照组空质粒组MnS OD 组0%CSE 410±018411±111413±0165%CSE 615±019#714±019#519±110#10%CSE915±110#918±115#812±017#注:与空质粒组比较, P <0105; #与同组内相邻前一浓度比较,P <0105余种化学物质, 包括高浓度的自由基和氧化剂, 对气道上皮细胞产生直接损伤2。香烟介导的氧化应激反应在COP D 的发病中起着不可忽视的作用3。一、基因转染的方法向细胞内导入外源基因的方法

21、可以分为两类:非病毒转导法:如DNA 2磷酸钙沉淀法、电穿孔法、显微注射法、脂质体介导法、DNA 直接注射、基因枪等。病毒介导法:是目前实际研究中主要采用的基因转移方法, 以逆转录病毒和腺病毒载体的运用最广泛, 尤其是腺病毒以其安全性好, 可感染宿主范围大, 易于制备、纯化和浓缩, 以及病毒滴度高等特点而得到广泛应用。本实验采用腺病毒介导MnS OD 基因, 成功转染了ECV304细胞。二、吸烟对内皮细胞氧化损伤和凋亡的影响及其可能机制氧自由基可以攻击生物膜的多不饱和脂肪酸, 引起脂质过氧化作用, 并形成脂质过氧化物如MDA , 所以检测MDA 的量可以反映脂质过氧化的程度, 间接反映出氧化损

22、伤的水平。Betsuyaku 6研究不同年龄段抽烟者与不抽烟者肺泡灌洗液中谷胱甘肽含量发现, 抽烟组明显低于不抽烟组, 提示吸烟可以导致肺部氧化应激水平升高。Segura 2Valdez 等7通过研究COP D 患者离体肺组织发现, 较对照组比较, 肺气肿内皮细胞凋亡明显增高。Banerjee 等8通过熏烟法建立起几内亚猪的肺气肿模型后, 发现动物体内羰基合物及凋亡明显增强, 二者存在相关性, 表明吸烟引起的细胞凋亡与局部氧化损伤有关。834本研究将香烟烟雾提取物直接作用于内皮细胞, 模拟吸烟后烟雾化学成分吸收入血循环这一过程, 期望了解CSE 对内皮细胞氧化损伤及凋亡的影响。我们发现, CS

23、E 可以浓度和时间依赖性地导致内皮细胞氧化损伤及凋亡。我们推测其可能机制是, 一方面, 香烟中大量液相毒素被吸收入血, 直接刺激血管内皮细胞, 触发内皮细胞的氧化损伤, 引起凋亡。另一方面, 香烟中大量的液相毒素进入气道后, 直接引起气道上皮细胞的功能障碍、死亡, 此过程中释放的大量溶酶体、炎性介质等可作为应激原, 触发氧化应激, 并释放大量自由基, 作用于与上皮细胞紧密相连的内皮细胞, 引起凋亡2。三、腺病毒介MnS OD 基因可部分抑制香烟致内皮细胞氧化损伤及凋亡超氧化物歧化酶(S OD 9。, , 要途径, 所以MnS OD 是清除超氧阴离子的第一道防线,MnS OD 基因的表达和调控对

24、机体内自由基/自由基清除剂的平衡体系至关重要。Tuder 等10将抗氧化剂MnS OD 类生物M40419, 应用于VEGFR 阻断致肺气肿大鼠后发现, M40419可以明显减少氧化应激标志物的水平, 并可以使肺部凋亡明显减轻, 增殖现象明显增加。L ieberthal 等11发现, 生长因子缺乏导致的凋亡, 利用抗氧化剂后, 凋亡可以明显减轻。刘珊等12将香烟烟雾溶液作用于经维生素C 预处理的大鼠淋巴细胞, 检测细胞内自由基、脂质过氧化物, 发现维生素C 干预组较对照组细胞内自由基及脂质过氧化物水平明显降低。本研究将Ad 2LacZ 空质粒转染入内皮细胞, 在CSE 刺激下表达MDA 和凋亡

25、与对照组比较无显著性差异, 排除了转染过程中引起的氧化损伤和凋亡。本研究将Ad 2MnS OD 基因转染入内皮细胞, 然后以CSE 刺激, 发现内皮细胞表达MDA 及凋亡率较空质粒组明显较少。因此可以得出结论, 腺病毒介导的MnS OD 可以部分抑制CSE 致内皮细胞氧化损伤及凋亡。推测其可能的机制是, 氧化应激使细胞内氧化还原状态发生改变, 调节转录因子活性及基因表达, 从而使调节细胞增殖的信号传导通路发生改变13; 通过激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(cas pase 28 , 下调凋亡抑制基因Bcl 22表达和诱导Bax 移位致线粒体, 增强凋亡启动因子和细胞色素C 的释放, 最后在

26、凋亡级联过程中通过激活cas pase 29和cas pase 23而触发凋亡14; 还可以通过下调缺氧诱导因子1(H I F 21 表达和改变线粒体、核糖体、内质网等细胞器的超微结构, 从而影响细胞的营养物质供应和能量代谢。而MnS OD 可以改变细胞内NO 、H 2O 2、超氧阴离子的含量, 通过阻断以上途径来达到抑制凋亡的作用。综上所述, 我们认为在吸烟可以直接引起内皮细胞氧化损伤及凋亡, Ad 2MnS OD 基因转染可以部分逆转这种效应, 为抗氧化剂应用于COP D 患者的临床治疗提供理论基础, 其具体机制尚不清, 还有待进一步深入研究。(4见插页第5页参考1. 慢性阻塞性肺疾病诊治

27、指南. 中华结核和呼吸杂志, 2002, 25:4532460.2Mac Nee W , Rah man I . Is oxidative stress central t o thepathogenesis of chr onic obstructive pul m onary disease? TrendsMolMed, 2001, 7:55262.3Rah man I, M ulier B, Gil m our PS, et al . Oxidant mediatedlung ep ithelial cell t olerance:the r ole of intracellular g

28、luta 2thi one and nuclear fact or kappa B. B i oche m Bhar macol, 2001, 62:787.4Yunchao S, W eihong H, Carl os G, et al . Effect of cigarettes moke exact on nitric oxide synthase in pul m onary artery endothelial cells . Am J Res p ir CellMol B i ol, 1998, 19:8192825.5周锐, 邓洁, 陈平. 腺病毒介导的MnS OD 转染对肺癌细

29、胞生长及体内抗肿瘤作用的影响. 中国现代医学杂志,2001, 8:58261.6Betsuyaku T . Oxidative stress in pathogenesis of COP D.N i ppon R insho, 2007, 65:6332636.7Segura 2Valdez L, Pardo A, Gaxi ola M , et al . Up regulati on ofgelatinases A and B, collagenases 1and 2, and increased parenchy mal cell death in COP D. Chest, 2000,

30、117:6842694.8Banerjee S,M aity P,Mukherjee S, et al . B lack tea p reventscigarette s moke 2inducedapop t osisand lung da mage . J I n 2fla mm (Lond , 2007, 14:3.9Eravad A. S OD2. a ne w type of tu mor 2supp ress or gene? I ntJ Cancer, 1992, 51:4762480.10Tuder R M , Zhen L, Cho CY, et al . Oxidative

31、 stress and ap 2op t osis interact and caue e mphyse ma due t o vascular endo 2thelial gr owth fact or recep t or bl ockade . Am J Res p ir Cell Mol B i ol, 2003, 29:88297.(下转第435页934 等5应用抗MCP 21抗体可抑制单核细胞趋化活性, 进一步说明MCP 21对单核/巨噬细胞具有趋化作用。研究报道6支气管上皮细胞MCP 21mRNA 的表达与巨噬细胞、肥大细胞的数量及其上的趋化因子受体2(CCR2 的表达有关。近来

32、发现7, 8COP D 患者支气管上皮及肺组织MCP 21表达增加。以上研究提示MCP 21可能与COP D 气道炎症有关。本研究显示COP D 患者血清MCP 21水平明显高于正常对照组, COP D 急性加重期又明显高于稳定期, 且与呼吸功能呈负相关, 说明MCP 21参与了COP D 气道炎症的发生发展。TGF 2是一类结构密切相关、功能近似的多肽类物质, 对细胞具有双向调节作用。研究显示,COP D 患者气道成纤维细胞数明显增多, TGF 21表, TGF 2191, COP D 厚, 胶原含量增加, TGF 21与气道平滑肌厚度、胶原厚度呈正相关10。本研究中, COP D 患者血清

33、TGF 21水平明显高于正常对照组, COP D 急性加重期又明显高于稳定期, 且与呼吸功能呈负相关, 说明TGF 21可能参与COP D 的气道重塑。应用MCP 21或TGF 21抗体或拮抗剂有可能阻断炎性细胞浸润或气道重塑, 为COP D 的防治提供新的思路。参考文献1Heino J, I gnotz RA, He m lerME, et al . Regulati on of cell ad 2hesi on recep t ors by transfor m ing gr owth fact or 2beta . Con 2com itant regulati on of integr

34、ins that share a common beta 1subunit . J B i ol Che m, 1989, 264:3802388.2江向宁, 车东媛, 邓仲端, 等. 低氧对人胚肺成纤维细胞转化生长因子21表达的影响. 基础医学与临床, 2000, 20:26229.3中华医学会呼吸病学分会. 慢性阻塞性肺疾病诊治指南. 中华结核和呼吸杂志, 2002, 25:4532460.4Luster AD. Che mokines 2che motactic cyt okines that mediateinfla mmati on . N Engl J Med, 1998, 338

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36、 and chr onic air ways infla on in COP D. J 6192626. 7itter M . Characterizati on oft ors p cells:str ong i T poly (I C on the regulati on of recep t ors, adap t or p r oteins and infla mmat ory re 2s ponse . J I nfla mm (Lond , 2005, 29:16.8Tomaki M , Sugiura H, Koarai A, et al . Decreased exp res 2si on of anti oxidant enzy mes and increased exp ressi on of che mokines in C OP D lung . Pul m Phar macol Ther . 2007, 20:5962