膈下迷走神经切断术抑制腹腔给予LPS诱导的延髓内脏带内Fos表达

1、膈下迷走神经切断术抑制腹腔给予LPS诱导的延髓内脏带内Fos表达【摘要】目的研究迷走神经在免疫系统至延髓内脏带(MVZ)通路中的可能性。方法对雄性SD大鼠行膈下双侧迷走神经干切断术或假切断手术，存活4周后再经腹膜腔注入免疫刺激剂脂多糖(LPS)或无菌生理盐水(NS)，3h后处死，用免疫组织化学ABC法对MVZ进行Fos染色。结果假手术组大鼠腹腔给予LPS后，MVZ可发现大量Fos表达；膈下迷走神经切断术组大鼠腹腔给予LPS后，MVZ内的Fos表达量则明显减少。结论迷走神经参与外周免疫信息向中枢的传递，外周免疫信息可经迷走神经传至MVZ，MVZ是“免疫-脑通讯”的中继站，机体内存在“迷走神经MV

2、Z”神经免疫调节通路。【关键词】延髓内脏带；神经免疫调节；膈下迷走神经切断术；Fos；脂多糖；免疫组织化学【中分类号】R322.81【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)02-97 SUBDIAPHRAGAMATIC VAGOTOMY INHIBITS Fos EXPRESSION INTHE MEDULLARY VISCERAL ZONE AFTER INTRAPERITONEALADIMINISTRATION OF LIPOPOLYSACCHARIDEYANG Zhi-jun,RAO Zhi-ren,QIU Jian-yong,JU Gong(Institute of

3、Neuroscience,the Fourth Military Medical University, Xian 710032,China)【Abstract】Objective To test the possibility that the vagus nerve is involved in the communication between the immune system and the medullary visceral zone(MVZ). Methods Male Sprague-Dawley rats were received either subdiaphragma

4、tic vagotomy or sham operation.Four weeks later,rats were challenged with pyrogen-free saline or lippolysaccharide(LPS) by intraperitoneal route,and sacrificed 3hrs later.Medulla sections were processed for Fos immunoreactivity using ABC method. Results Intraperitoneal LPS caused robust Fos expressi

5、on within the MVZ in the sham surgery groups and this response in the MVZ was inhibted in the vagotomized rats. Conclusions This study suggested that the abdominal vagus nerve consituted an important immune signaling pathway from immune system to the MVZ,and MVZ was a relay station in the immune-to-

6、brain communication.MVZ might play a prominent role in the neuroimmunomodulation via vagus-to-MVZ neuroimmunomodulatory pathway.【Key words】 Medullary visceral zone;Neuroimmunomodulation;Subdiaphragamatic vagotomy;Fos;Lipopolysaccharide;Immunohistochemistry现已公认中枢神经系统与免疫系统之间存在相互调节，但中枢神经系统哪些部位参与免疫调节是一个

7、尚未解决的问题。有文献证实，下丘脑室旁核(PVN)的催产素(oxytocin)能神经元，可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)或下丘脑-脊髓-交感神经轴参与免疫调节1。近年研究发现大鼠、猴和人的延髓中尾段均存在一条从背内侧经中间网状结构至腹外侧的弧形带状区，因与内脏活动(心血管、呼吸和胃肠活动等)有密切关系，故称之为延髓内脏带(medullary visceral zone,MVZ),MVZ这一新的概念已被国际学术界认可2。MVZ被划分为背内侧部DM，包括孤束核(NTS)、迷走神经背运动核(dmnX)及最后区(AP)、腹外侧部VLM，包括疑核(nA)、外侧网状核(LRt)及腹外侧网状核(VL

8、Rt)和中间网状带(IRt，指位于两者之间的弧形网状带)三部分，延髓生命中枢位于MVZ内3。MVZ对免疫反应的刺激也很活跃，将免疫激活剂脂多糖(LPS)注入腹腔4或将白细胞介素-1(IL-1)注入侧脑室5，均在MVZ内见到许多Fos阳性神经元，其中多为儿茶酚胺能，有的投射至脊髓中间带外侧核。迷走神经可能是“免疫-脑通讯”(immune-to-brain communication)的途径之一，机体内可能还存在“MVZ-迷走神经-免疫器官”的“免疫-脑通讯”调节通路。为此，我们切断大鼠双侧膈下迷走神经，观察再经腹腔给予LPS后MVZ内的Fos表达情况，以证明“迷走神经MVZ”通路参与神经免疫调节

9、的可能性。材料和方法成年雄性上海SD大鼠24只，体重180230g，置于安静、温暖(20)、避强光的环境中饲养48h，随机分为实验组(n=20)和对照组(n=4)。1. 实验组1.1动物手术及切片制备(n=20)：实验组动物进一步随机分为迷走神经切断(SDV)组(n=10)和假手术(Sham)组(n=10)。SDV组动物经1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉下行剖腹术，在手术显微镜下，于胃小弯处暴露迷走神经左右两干支，距离迷走神经各分支(胃支、肝支和腹腔支)约5mm，丝线结扎左右两干支并切断。Sham组动物，同样暴露迷走神经左右两干支，但不结扎也不切断迷走神经。术后给予固体食物。动物存

10、活4周后，乙醚吸入麻醉，腹腔分别注射300l灭菌生理盐水溶解的LPS(Sigma,0127:B8,100g/kg)和300l灭菌生理盐水(NS)，动物再存活3h。戊巴比妥钠深麻下，开胸经左心室至升主动脉插管，先以100ml生理盐水冲洗血液，随后用冷的(4)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)灌流固定。灌毕取脑置于含30%蔗糖的0.1mol/L PB内(4)，直至组织块沉底。切取延髓，冰冻连续冠状切片，片厚30m,隔6张取1张。1.2染色反应：切片则按ABC法进行抗Fos免疫组织化学反应，切片先入含0.3%Triton X-100的PBS浸泡30min(室温)，后依次

11、入：(1)兔抗Fos抗体稀释液(11 000，Santa Cruz)，孵育48h(4)；(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1500,Sigma)，放置3h(室温)；(3)生物素-卵白素-HRP复合物(ABC，1500,Sigma)，放置3h(室温)。最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法呈色。以上每一步骤之后均用PBS液充分漂洗3次，每次10min。切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封固，光镜下观察并摄片。1.3数据处理：切片经像分析仪(Quantimet570C,Leica)处理。Fos阳性细胞计数分别选择MVZ内DMM、IRt和VLM。每只大鼠随机选取一套延髓切片，在10(目镜)20(物镜)

12、倍率下，计算该套切片中MVZ内上述各部Fos阳性细胞的总和，而后在每组动物间取均数。最后各实验组之间Fos阳性细胞数比较采用t检验进行统计分析。1.4免疫组织化学染色替代实验：取实验组大鼠延髓切片，用0.01mol/L PBS代替兔抗Fos第一抗体，再按ABC法进行免疫组织化学染色。2. 对照组2.1空白对照实验(n=2)：正常大鼠在上述安静环境饲养48h后，不经手术处理，戊巴比妥钠麻醉下灌流固定、取材，延髓切片按ABC法进行Fos免疫组织化学染色。2.2生理盐水对照实验(n=2)：正常大鼠在乙醚吸入麻醉后，经腹腔注入300l NS，存活3h后，戊巴比妥钠麻醉下灌流固定、取材。延髓切片进行Fo

13、s免疫组织化学染色。结果1. 假手术组动物存活4周后腹腔注射NS组(Sham-NS组)，MVZ内可发现少数浅染的Fos阳性细胞。腹腔注射LPS组动物(Sham-LPS组)，则在MVZ内发现大量的Fos阳性细胞，多数为深染(1，3)。两侧呈对称性分布，无侧别差异。从延髓尾吻方向看，Fos阳性细胞由尾侧向吻侧逐渐增多，但闩吻侧平面较少。从横切面上看，Fos阳性细胞多集中分布于DMM内的孤束核联合亚核(nCOM)、内侧亚核(mNTS)和AP，其次分布于VLM、IRt内Fos阳性细胞相对较少，主要分布于IRt内侧部。dmnX和nA内均未见Fos阳性细胞分布。2.迷走神经切断组动物存活4周后腹腔注射NS

14、组(SDV-NS组)，MVZ内仍可发现少数浅染的Fos阳性细胞，与Sham-NS组比较相差显著(P0.01)。腹腔注射LPS组动物(SDV-LPS组)，MVZ内Fos阳性细胞较Sham-LPS组明显减少(2，4)，相差非常显著(P0.01)，AP内仍可见到Fos阳性细胞表达，但较Sham-LPS组AP内的Fos阳性细胞略有减少，相差不显著；Fos阳性细胞在MVZ内的分布较Sham-NS和SDV-NS组明显增加(P0.01)。SDV-LPS组MVZ内的Fos阳性细胞多数为浅染，两侧呈对称性分布，无侧别差异。从延髓尾吻方向看，Fos阳性细胞主要集中在延髓AP平面上，其他平面相对较少。横切面上看，F

15、os阳性细胞多集中分布于DMM内AP和mNTS,VLM和IRt内Fos阳性细胞相对较少。dmnX和nA内均未见Fos阳性细胞分布。Fos阳性细胞数在以上4组动物MVZ内的数量见附表。附表Fos阳性细胞数在MVZ内的数量()Table The numbers of Fos positive neurons within the MVZ()部位area假手术组sham surgery group迷走神经切断组subdiaphragmatic vagotomy groupNS(n=4)LPS(n=6)NS(n=4)LPS(n=6)最后区AP3.703.0983.9042.46a22.2010.675

16、9.3028.69b,d孤束核 NTS10.105.13256.3882.37a53.8035.7295.7351.53c,e中间网状带IRt1.001.0555.5517.93a7.253.7611.005.31c,f腹外侧部VLM8.103.56120.4533.65a26.5012.4263.0334.27c,e延髓内脏带MVZ20.108.35453.35132.91a93.1041.31184.5873.46c,e a P0.01，与Sham-NS组比较；b P0.05，c P0.01，与Sham-LPS组比较；d P0.05，e P0.01，fP0.05与SDV-NS组比较aP0.

17、01 vs Sham-NS group；b P0.05，c P0.01，vs Sham-LPS；d P0.05，e P0.01，fP0.05 vs SDV-NS group3. 对照组和免疫组织化学替代染色在进行空白对照和生理盐水对照实验的延髓切片上，仅在MVZ的DMM和VLM内有少数浅染Fos样阳性细胞。免疫组织化学染色替代实验，Fos染色结果为阴性。 讨论众所周知，动物和人体内存在着神经-免疫调节网络，近10年来，关于神经系统和免疫系统之间关系的研究是目前国内外学术界的研究热点之一。由于此项工作尚处于起步阶段，对中枢神经系统在免疫应答中的作用，认识仍很肤浅。当机体受到某种刺激(如伤害性刺激

18、、免疫刺激等)时，在该刺激信息向中枢传导的神经通路上，多数神经元均会出现Fos蛋白阳性表达，用免疫组织化学方法可以将其显示出来。Fos蛋白形态学显示方法的建立也为研究免疫刺激信息的传导通路提供了一个快捷、敏感和方便的研究手段。虽然结果是通过形态学方法显示，但在某种程度上反映了一定的功能意义，因此是一种形态学和功能学相结合的手段。多种刺激均可引起Fos蛋白阳性表达，而且在一定条件下胶质细胞也会有反应。对于阴性结果的分析尤应慎重，有时会由于神经元回路是抑制性而导致Fos蛋白表达阴性。但在严格控制实验条件的前提下，Fos显示方法仍是一种非常方便和分辨率很高的方法。因此，实验中我们尽量减少外界非特异性

19、刺激，同时进行对照实验，以保证结果的特异性。LPS是革兰阴性杆菌的细胞壁成分，能刺激免疫细胞分泌IL-1、肿瘤坏死因子-(TNF-)和白细胞介素-6(IL-6)等多种细胞因子，在免疫应答研究中常被作为一种多克隆免疫激发剂来模拟机体免疫激发状态。多数学者认为，LPS引起的与神经活动有关的中枢效应主要是由IL-1为主的细胞因子介导的。特异性IL-1受体拮抗剂可以阻断LPS产生的HPA轴效应及行为效应6。免疫刺激对脑的影响主要通过免疫系统产生的多种细胞因子，但其入脑途径却不甚清楚。目前认为主要通过以下途径：1.血源性机制(blood-borne mechanisms)。细胞因子通过缺乏血脑屏障(BB

20、B)的室周器官(CVOs)直接传送至脑，或与载体结合穿过BBB进入脑内，或与大脑血管内皮细胞上的受体结合诱导中枢性免疫调质(如前列腺素)并可作为第二信使自由弥散通过BBB将免疫信息传入脑内79；2.神经性“细胞因子-脑通讯”机制10。细胞因子激活外周传入神经，近年来认为主要是激活迷走神经。LPS经腹腔注射时，发热等中枢性反应的出现先于血液中细胞因子浓度的升高，用LPS先引起细胞因子生成再传递至中枢途径不能解释11。相反，这些中枢介导的疾病反应可由膈下切断迷走神经所阻遏，说明迷走神经在其中起着重要作用。Day等12发现，由侧脑室途径注射IL-1在下丘脑PVN内c-fos mRNA表达量比经腹腔途

21、径注射IL-1要多，而腹腔途径给予IL-1则c-fos mRNA在NTS、中央杏仁核内的表达量是侧脑室途径的34倍，因此认为这是由于迷走神经被激活所致。Ericsson等13认为静脉注入IL-1，信息可经舌咽神经、迷走神经的感觉传入支兴奋NTS及延髓腹外侧区神经元。这些结果均表明迷走神经是“细胞因子-脑通讯”的途径之一，在免疫信息向神经信号的转换和传递中起重要作用。在神经免疫调节的研究中，常将下丘脑作为焦点。Ju等1发现下丘脑PVN(特别是其前大细胞亚核)是免疫应答的一个重要整合中枢。当前一般注意的焦点是HPA轴和下丘脑-脊髓-交感神经轴。已有许多实验支持这两条径路在神经免疫调节中起着重要作用

22、。实际上神经系统参与免疫调节的机制是很复杂的，除了上述两种神经免疫调节通路外，可能还存在其他的调节通路。MVZ作为一个独特的机能结构区，有着复杂而重要的功能。它是内脏感觉传递中继站，参与躯体-内脏感觉的会聚，并将信息传至中枢其他部位(前脑边缘系、下丘脑和脑干等)2，3。MVZ也参与神经免疫调节活动4，5，14。本实验研究了LPS经腹腔注射对MVZ的作用，结果发现Sham-LPS组动物可在MVZ内发现大量的Fos阳性细胞，SDV-LPS组动物MVZ内Fos阳性细胞较Sham-LPS组明显减少，但AP内仍可发现大量Fos阳性细胞，较Sham-LPS组AP内的Fos阳性细胞数略有所减少，相差不显著。

23、膈下迷走神经切断术能明显抑制腹腔注射LPS引起的MVZ内FOS表达，进一步说明MVZ可以参与免疫调节，LPS经腹腔激发的免疫信息可通过迷走神经至MVZ向脑传递，体内存在“迷走神经-MVZ”调节通路。由于AP缺乏血脑屏障，免疫信息经AP直接传送至脑的途径不受切断迷走神经影响。本研究同时也观察到SDV-NS组大鼠MVZ内仍可以发现少数浅染的Fos阳性细胞，较Sham-NS组MVZ内Fos阳性细胞多(P0.01)，本现象可以解释为迷走神经切断术后造成的一些副反应(如胃膨胀等)刺激交感神经传入支通过脊髓再传至MVZ，进而引起MVZ内出现少量Fos表达。经腹腔或侧脑室途径给予LPS，亦可以兴奋下丘脑PV

24、N、视上核和边缘结构等区域，表现为出现Fos阳性表达15。MVZ与PVN存在直接的往返联系。MVZ内的儿茶酚胺能神经元可投射至PVN内促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)阳性区域13，MVZ内对LPS刺激起反应的儿茶酚胺能神经元也可投射至PVN。PVN也可发出纤维投射至MVZ，其中PVN内的CRH和Oxytocin能神经元对MVZ可能起着一定的调节作用。将IL-1注入侧脑室，MVZ内TH阳性神经元出现Fos表达，其中一部分可投射至脊髓中间带外侧核5。而且，膈下迷走神经切断术可以明显抑制下丘脑PVN内的Fos阳性表达。因此我们认为，迷走神经在免疫信息向神经信号的转换及传递过程中起重要的作用，MVZ

25、是免疫信息到达下丘脑等高位中枢的中继站，推测机体除了HPA轴和下丘脑-脊髓-交感神经轴外，还可通过“下丘脑等高位中枢-MVZ-迷走神经”和“下丘脑等高位中枢-MVZ-脊髓-交感神经”两条径路起神经免疫调节作用。【基金项目】国家自然科学基金资助项目(No.39770251)作者简介：杨志军(1970)，男(汉族)，黑龙江省海伦市人，博士，医师作者单位：杨志军(第四军医大学神经科学研究所， 西安 710032)饶志仁(第四军医大学神经科学研究所， 西安 710032)邱建勇(第四军医大学神经科学研究所， 西安 710032)鞠躬(第四军医大学神经科学研究所， 西安 710032)参考文献1Ju G

26、,Zhang X,Jin BQ,et al.Activation of corticotrophin-releasing-factor-containing neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus by interleukin-1 in the ratJ. Neurosci Lett,1991,132(2):151-154.2Li T,Gao W,Rao ZR.Noxious somatic stimulation-induced expression of Fos-like immunoreactivity in

27、catecholaminergic neurons with habenular nucleus projection in the medullary visceral zone of ratJ.Brain Res,1998,783(1):51-56.3Rao ZR,Ju G.Morphology of the medullary visceral zoneJ.Chin Sci Bull,1999,44(1):1-104袁祥鹏，鞠躬.多克隆免疫激发剂LPS免疫激发大鼠引起下丘脑和脑干核团c-fos表达J.解剖学报，1997，28(2)：137-141.5王凌，饶志仁，邱建勇.侧脑室注射白细胞

28、介素1对大鼠延髓内脏带儿茶酚胺能神经元兴奋作用及脊髓的投射关系J.解剖学杂志，1996，19(增刊)：1216Kent S,Bluthe RM,Dantzer R,et al.Different receptor mechanisms mediate the pyrogenic and behavioral effects of interleukin-1J.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(19):9117-9120.7Stitt JT.Passage of immunomodulators across the blood-brain barrierJ.Yale

29、 J Biol Med,1990,63(2):121-131.8Ban Dam AM,Bround M,Man A,et al.Immunocytochemical detection of prostaglandin E2 in microvasculature and in neurons of rat brain after administration of bacterial endotoxinJ.Brain Res,1993,613(2):331-336.9Banks WA,Katin AJ.Blood to brain transport of interleukin links to the immune and central nervous systemJ.Life Sci,1991,48(25):PL117-121.10Watkins LR,Maier SF,Gohler LE.Cytokine-to-brain communication:a review and analysis of alternative mech