饲料中霉菌毒素检测技术

1、饲料中霉菌毒素检测技术 交流提纲交流提纲一、饲料中霉菌毒素的危害饲料中霉菌毒素的危害 二二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法、饲料中霉菌毒素的主要检测方法 三、三、ELISAELISA法的操作要点及注意事项法的操作要点及注意事项 质量第一质量第一 公正科学公正科学 及时准确及时准确四、四、 HPLC法在饲料霉菌检测中的应用一、饲料中霉菌毒素的危害 1、什么是霉菌毒素？、什么是霉菌毒素？真菌霉菌抗生素霉菌毒素酵母蕈菌霉菌毒素是霉菌产生的次级代谢产物次级代谢产物次级代谢产物一、饲料中霉菌毒素的危害 2、霉菌毒素产生的原因、霉菌毒素产生的原因霉菌无处不在，它们可在农作物生长、收获、运输和储存期间生长并产

2、生毒素农作物作为饲料原料在生产、销售、储存、运输过程中如果受到霉菌污染也会发生霉变、遭受霉菌毒素污染一、饲料中霉菌毒素的危害 3、霉菌毒素的种类、霉菌毒素的种类u现已报道的霉菌毒素大约有300种u在饲料中常见的、对人和动物健康造成潜在危害的毒素主要有：黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素和脱氧雪腐镰刀菌稀醇（呕吐毒素）等6种毒素一、饲料中霉菌毒素的危害 4、霉菌毒素的主要危害、霉菌毒素的主要危害u一是一是可以引起饲料的变质，产生异味，降低其饲用价值，甚至完全让其失去商品价值u二二是是饲料被霉菌污染后，导致畜禽的急、慢性中毒，免疫机能和生产性能下降，造成养殖业效益的下降u三

3、三是是残留于畜禽肌肉、内脏或乳中的霉菌毒素通过食物链传递给消费者，给食品安全带来更大的风险二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法 1、饲料中主要霉菌毒素的检测、饲料中主要霉菌毒素的检测标准一览表标准一览表霉菌毒素名称霉菌毒素名称标准号标准号标准名称标准名称检测方法检测方法黄曲霉毒素黄曲霉毒素GB/T 30955-2014GB/T 30955-2014饲料中黄曲霉毒素饲料中黄曲霉毒素B1B1、B2B2、G1G1、G2G2的测定的测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法免疫亲和柱净化高效液相色谱法高效液相色谱法（荧光）高效液相色谱法（荧光）GB/T 17480-2008GB/T 17480-2008饲料中黄曲

4、霉毒素饲料中黄曲霉毒素B1B1的测定的测定 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法GB/T 8381-2008GB/T 8381-2008饲料中黄曲霉毒素饲料中黄曲霉毒素B1B1的测定的测定 半定量薄层色谱法半定量薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法NY/T 2071-2011NY/T 2071-2011饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2T-2毒素的测定液相色谱毒素的测定液相色谱- -串联质谱法串联质谱法液相色谱液相色谱- -串联质谱法串联质谱法NY/T 2550-2014NY/T 2550-2014饲料中黄曲霉毒素饲料中黄曲霉毒素B1B1的测定

5、的测定 胶体金法胶体金法胶体金法胶体金法NY/T 2549-2014NY/T 2549-2014饲料中黄曲霉毒素饲料中黄曲霉毒素B1B1的测定的测定 免疫亲和荧光光度法免疫亲和荧光光度法荧光光度法荧光光度法NY/T 2548-2014NY/T 2548-2014饲料中黄曲霉毒素饲料中黄曲霉毒素B1B1的测定的测定 时间分辨荧光免疫层析法时间分辨荧光免疫层析法免疫层析法免疫层析法DB37/T 2617-2014DB37/T 2617-2014饲料中黄曲霉毒素饲料中黄曲霉毒素B1B1的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法玉米赤霉烯酮玉米赤霉烯酮GB/T 28716-

6、2012 GB/T 28716-2012 饲料中玉米赤霉烯酮的测定饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化免疫亲和柱净化- -高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（荧光）高效液相色谱法（荧光）GB/T19540-2004GB/T19540-2004饲料中玉米赤霉烯酮的测定饲料中玉米赤霉烯酮的测定薄层色谱法薄层色谱法 酶联酶联免疫吸附法免疫吸附法DB51/T 1080-2010 DB51/T 1080-2010 饲料中玉米赤霉烯酮的测定饲料中玉米赤霉烯酮的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法DB22/T 1618-2012DB22/T 1618-2012饲料中玉米

7、赤霉烯酮的测定饲料中玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱液相色谱- -质谱质谱/ /质谱法质谱法液相色谱液相色谱- -串联质谱法串联质谱法脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）（呕吐毒素） GB/T 30956-2014GB/T 30956-2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法免疫亲和柱净化高效液相色谱法高效液相色谱法（紫外）高效液相色谱法（紫外）GB/T 8381.6-2005GB/T 8381.6-2005配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法DB51/T

8、1079-2010DB51/T 1079-2010饲料中呕吐毒素的测定高效液相色谱法饲料中呕吐毒素的测定高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法赭曲霉毒素赭曲霉毒素A AGB/T 30957-2014GB/T 30957-2014饲料中赭曲霉毒素饲料中赭曲霉毒素A A的测定的测定 免疫亲和柱净化高效液相色谱法免疫亲和柱净化高效液相色谱法高效液相色谱法（荧光）高效液相色谱法（荧光）GB/T19539-2004GB/T19539-2004饲料中赭曲霉毒素饲料中赭曲霉毒素A A的测定的测定薄层色薄层色谱方法谱方法 酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法DB51/T 1081-2010DB51/T 1

9、081-2010饲料中赭曲霉毒素饲料中赭曲霉毒素A A的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法T-2T-2毒素毒素GB/T 28718-2012GB/T 28718-2012饲料中饲料中T-2T-2毒素的测定毒素的测定 免疫亲和柱净化免疫亲和柱净化- -高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（荧光）高效液相色谱法（荧光）GB/T 8381.4-2005GB/T 8381.4-2005配合配合饲料中饲料中T-2T-2毒素的测定薄层色谱法毒素的测定薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法DB51/T 1078-2010DB51/T 1078-2010饲料中饲料中T-2T-2

10、毒素的测定高效液相色谱法毒素的测定高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法伏马毒素伏马毒素NY/T1970-2010NY/T1970-2010饲料中伏马毒素的测定（伏马毒素饲料中伏马毒素的测定（伏马毒素B1B1和伏马毒素和伏马毒素B2B2含量）含量）液相色谱串联质谱法液相色谱串联质谱法 高效液相色谱法（荧光）高效液相色谱法（荧光）DB51/T 1082-2010DB51/T 1082-2010饲料中伏马毒素饲料中伏马毒素B1B1的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法 2、霉菌毒素的主要检测方法、霉菌毒素的主要检测方法 胶体金免疫

11、层析法 酶联免疫吸附法 荧光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱（荧光/紫外）法 高效液相色谱串联质谱法二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法 3、主要检测方法的特点比较、主要检测方法的特点比较色谱方法色谱方法ELISA试纸条试纸条样品处理复杂，需要净化柱纯化操作简单，只需萃取过滤 简单，只需萃取过滤 检测时间 30-60分钟30-60分钟 5-10分钟检测通量单个样品，一种或多种毒素多个样品，一个毒素单种样品仪器成本昂贵（HPLC,LC-MS/MS）便宜 （酶标仪）无需仪器准确度高中低检测成本 昂贵 便宜便宜人员技术要求专业技术背景 复杂的培训 无需专业背景，简单培训 无需专业背景，简单培训 样品要求

12、几乎可以处理任何样品对样品基质要求高对样品基质要求非常高检测效率可以进行多毒素检测只能完成单一毒素检测只能完成单一毒素检测二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法 4、检测方案、检测方案胶体金阳性样确证高效液相液质联用荧光分析初筛ELISA批量样本可疑样品二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法 5、检测流程、检测流程取样取样 GB/T14699.1 2005 饲料饲料 采样采样制样制样 GB/T20195 动物饲料动物饲料试样的制试样的制备备萃取萃取净化净化（主要用于色谱法）分析测试三、ELISA法的操作要点及注意事项 1、酶联免疫吸附（、酶联免疫吸附（ ELISA ）试验的定义及分类）试验的定义及分类定义

13、：用定义：用酶标记抗原或抗体检测酶标记抗原或抗体检测液体中液体中未知抗体或抗原的方法未知抗体或抗原的方法。将将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测抗检测液相中未液相中未知抗体知抗体将已知将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测抗检测液液相中的可溶性抗原相中的可溶性抗原将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体分类：分类：三、ELISA法的操作要点及注意事项 2、竞争、竞争 ELISA 的原理的原理三、ELISA法的操作要点及

14、注意事项 2、检测步骤及、检测步骤及注意事项注意事项（1）准备阶段）准备阶段 详细阅读说明书详细阅读说明书 确认试剂盒试剂组成、数量及其用途确认试剂盒试剂组成、数量及其用途 试剂配制试剂配制 试样的制备、提取及稀释试样的制备、提取及稀释 试剂盒试用前要充分回温试剂盒试用前要充分回温 实验室室温最好控制在实验室室温最好控制在20-2520-25 准备好实验器具（移液枪机及枪头）准备好实验器具（移液枪机及枪头） 确认仪器设备运行正常确认仪器设备运行正常三、ELISA法的操作要点及注意事项 2、检测步骤及、检测步骤及注意事项注意事项（续）（续）（2 2）加样）加样u 标准曲线孔标准曲线孔- - 酶标

15、抗原酶标抗原 + + 标准曲线溶液标准曲线溶液u 样品测试孔样品测试孔- - 酶标抗原酶标抗原 + + 样品提取物溶液样品提取物溶液 注意事项：注意事项： 加样体积准确加样体积准确 前后加样时间不宜过长前后加样时间不宜过长 不可漏孔、跳孔不可漏孔、跳孔 防止交叉污染防止交叉污染三、ELISA法的操作要点及注意事项 2、操作要点及注意事项（续）、操作要点及注意事项（续）容易出现的问题容易出现的问题解决方法加样时间过长，导加样时间过长，导致前后反应时间差致前后反应时间差异大异大一次检测不要检测太多样品一次检测不要检测太多样品加样使用使用单枪，其他步骤使用排枪加样使用使用单枪，其他步骤使用排枪先将酶

16、标抗原和样品提取液在空白微孔板中混合均先将酶标抗原和样品提取液在空白微孔板中混合均匀，再用多通道移液器将混合液加到检测微孔板中匀，再用多通道移液器将混合液加到检测微孔板中交叉污染交叉污染枪头一次性使用枪头一次性使用试样加入试样加入后的后的 步骤枪步骤枪头不接触微孔头不接触微孔液体挂壁排不尽液体挂壁排不尽使用硅化枪头使用硅化枪头移取体积不一致移取体积不一致高质量移液枪高质量移液枪+配套墙头配套墙头+人员操作训练人员操作训练产生气泡产生气泡轻轻回形振荡轻轻回形振荡三、ELISA法的操作要点及注意事项 2、操作要点及注意事项、操作要点及注意事项(续续)（3 3）孵育）孵育 孵育前应混匀反应物孵育前应

17、混匀反应物 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求严格按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内防止微孔内液体挥发，加以密封液体挥发，加以密封（4 4）洗板）洗板 甩除液体要干净利落，不要投鼠忌器甩除液体要干净利落，不要投鼠忌器 加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染 拍板用力适当，看不到明显液体为宜拍板用力适当，看不到明显液体为宜三、ELISA法的操作要点及注意事项 2、操作要点及注意事项、操作要点及注意事项(续续)（5 5）显色）显色 加显色液要快速准确加显色液要快速准确 回形振荡混匀，消除气泡回形振荡混匀，消除气泡 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求严格

18、按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内防止微孔内液体挥发，加以密封液体挥发，加以密封（6 6）显色终止）显色终止 按照加显色液的顺序及速度加终止夜按照加显色液的顺序及速度加终止夜 回形振荡混匀液体回形振荡混匀液体三、ELISA法的操作要点及注意事项 2、操作要点及注意事项、操作要点及注意事项(续续)（6 6）读数（检测吸光度）读数（检测吸光度） 终止反应后应尽快检测吸光度终止反应后应尽快检测吸光度 按照说明书要求设置酶标仪参数按照说明书要求设置酶标仪参数三、ELISA法的操作要点及注意事项 3、其他应注意的问题、其他应注意的问题 劳动安全保护及环境保护劳动安全保护及环境保护 不同批次的试剂盒微孔板不要混用不同批次的试剂盒微孔板不要混用 试剂盒质量差异（重复性、准确性）明显试剂盒质量差异（重复性、准确性）明显 四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用 霉菌霉菌毒素毒素 名称名称提取液提取液净化净化检测器检测器备注备注黄曲霉毒素黄曲霉毒素甲醇甲醇- -水水免疫亲和柱免疫亲和柱多功能净化柱多功能净化柱荧光检测器荧光检测器串联质谱串联质谱荧光