人SonicHedgehog基因远距离增强子ZRS调节基因

1、论文：人Sonic Hedgehog基因远距离增强子ZRS调节基因表达机制的初步研究【中文摘要】Sonic Hedge基因在动物个体发育过程中起到形态发生素的作用,在多种器官和组织形成中发挥效用,如大脑,脊髓,丘脑,肢芽,上皮组织等,目前研究已经表明,在不同的组织中shh(Sonic Hedgehog)基因的表达是由不同的增强子序列调节起作用的。在肢芽中,shh的表达受到距离其上游1Mb远的一段保守序列ZRS (ZPA regulatory sequence)的调节,而当该序列内部出现点突变时,shh在肢芽部分的表达会发生变化,从而导致轴前多指畸形(PPD)这种严重遗传病的出现。ZRS序列本身

2、非常保守,在人、小鼠、大鼠、鸡、河豚中,目前已经有报道10个以上的点突变会引发肢芽部分的发育异常。本实验从病人样本的基因组中筛选到了一个没有被报道过的点突变(3C>G),PCR扩增了两种长度的含有点突变的DNA序列,并通过使用荧光素酶报告基因活性检测系统,在HEK-293A细胞中,发现具有点突变的ZRS序列和野生型的ZRS序列均具有增强子活性,而且活性是突变型的高于野生型的序列。对于这个突变体的生物信息学分析发现,该点突变可能会改变这段增强子序列的转录因子结合位点,因此使Shh基因的表达出现了异常。.【英文摘要】Sonic Hedgehog works like a morphogen

3、during the animal individual development. It functions in many organs, such as brain, spinal cord, thalamus, limb bud and epithelial cells. Recently reports show that in different tissues, different tissue specificity enhancers regulate shh expression. During limb bud shaping, the conserved ZRS sequ

4、ence locating IMbp upstream of the shh proximal promoter regulates shh expression as a long-range enhancer. And point mutation in this ZRS sequence would cause the preaxial p.【关键词】【英文关键词】Sonic hedgehog ZRS DAPA Luciferase Reporter Assay System Point Mutation【索购全文】联系Q1：138113721 Q2：139938848【目录】人Soni

5、c Hedgehog基因远距离增强子ZRS调节基因表达机制的初步研究中文摘要4-5Abstract5-6缩略词10-11第1章 前言11-161.1 Sonic Hedgehog基因简介11-131.2 shh基因表达调控模式简介13-151.3 本课题的实验目的、意义和研究策略15-161.3.1 实验目的和意义151.3.2 研究策略15-16第2章 实验材料和方法16-292.1 实验材料16-192.1.1 菌种和载体162.1.2 人血液样本162.1.3 细胞系和细胞培养基162.1.4 工具酶,试剂(盒)16-172.1.5 试剂的配制17-192.2 实验仪器192.3 实验方

6、法19-292.3.1 提取质粒DNA202.3.2 切胶回收DNA20-212.3.3 纯化PCR产物及酶切产物21-222.3.4 提取血液中的基因组DNA22-232.3.5 连接反应232.3.6 质粒DNA及连接产物转化感受态细胞23-242.3.7 菌落PCR鉴定阳性克隆242.3.8 SDS-PAGE电泳24-252.3.9 细胞复苏25-262.3.11 细胞冻存262.3.12 细胞计数26-272.3.13 HEK-293A细胞转染272.3.14 双荧光素酶报告基因检测系统27-29第3章 ZRS点突变的筛选29-363.1 从病人样本中调取ZRS序列并测序分析29-32

7、3.1.1 实验材料293.1.2 方法,结果及分析29-323.1.2.1 从病人血液样本中抽提基因组DNA并进行定量293.1.2.2 从提取的基因组中克隆带有ZRS序列的DNA片段29-313.1.2.3 4个病患样本中有2个出现了点突变31-323.2 病人样本基因组shh基因外显子序列的测序分析32-343.2.1 实验材料323.2.2 方法、结果及分析32-343.3 表型正常人的ZRS序列突变分析34-353.3.1 实验材料343.3.2 方法、结果及分析34-353.4 小结35-36第4章 双荧光素酶报告系统检测ZRS突变型和野生型的增强子活性36-464.1 构建pGL3-promoter-ZRS/BLZRS质粒36-404.1.1 实验材料364.1.2 方法,结果及分析36-404.2 转染HEK-293A细胞并检测荧光素酶活性40-454.2.1 实验材料404.2.2 方法,结果及分析40-454.3 小结45-46第5章 生物素标记ZRS特异性捕获与其作用的蛋白质46-565.1 实验材料465.2 方法,结果及分析46-565.2.1 制备带有生物标记的DNA探针并验证标记效率46-485.2.2 获取HEK-293A非变性细胞核蛋白并定量48-505.2.3