常染色体显性遗传多囊肾的多囊素表达

1、    常染色体显性遗传多囊肾的多囊素表达        【摘要】目的研究多囊素的细胞定位，了解正常肾脏与肾组织多囊素的表达及分布差别。方法应用多囊素合成肽单抗-抗pepPBP1和抗pepPBP3以及融合蛋白抗体-抗fpAH4，对3例正常肾组织和8例多囊肾组织的标本做免疫组织化学染色定位。结果正常肾组织的多囊素组织化学定位主要分布在远端小管和集合管，髓质部更明显，近端小管弱染或阴性，肾小球上皮细胞也可着染。8例多囊肾组织的染色细胞在28%60%，大多数为50%，囊肿上皮染色比

2、正常肾组织强，囊肿上皮染色强弱不同，少数囊肿上皮染色阴性。结论正常肾组织和多囊肾组织均可表达多囊素，多囊素染色以远端小管和集合管为主，细胞染色有差异性；多囊肾的囊上皮染色存在异质性。【关键词】多囊肾免疫组织化学多囊素 Expression of polycystin in autosomal dominant polycystic kidney diseaseYE Chaoyang*，Dominique Droz.*Department of Nephrology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shangha

3、i 200003【Abstract】ObjectiveIn order to identify the localization of polycystin(PC) in the cells and understand the expression and distribution difference of PC in the normal kidney and polycystic renal tissue. MethodsThe antibodies against 2 synthetic peptides, pepPBP1 and pepPBP3, and a fusion prot

4、ein fpAH4 corresponding to the predicted amino acid sequence of PC were used for immunostaining of normal renal and polycystic tissues. ResultsIn 3 cases of normal tissue ,PC was mainly localized to distal and collective tubeles with a finely granular cytoplasmic staining, especially in the medulla;

5、 proximal tubules was faintly positive or negative. In 8 cases of polycystic kidney, 28%60% of the cells were positive, being near 50% in the majority of cases; approximately 80% of non-cystic tubules expressed PC and cells staining were stronger positive than normal kidney. ConclusionPC is expresse

6、d either in polycystic kidney or in normal renal cells; PC is detected in cell lining nearly 50% of cysts wall also exhibiting some intercellular heterogeneity.【Key words】Autosomal dominant polycystic kidney diseaseImmunohistochemistryPolycystin常染色体显性遗传多囊肾病（ADPKD）是肾功能衰竭病因中最常见的遗传病，发病率为1/1000，多囊肾的发病目前

7、认为与三个位点有关，即PKD1,PKD2和PKD3。PKD1定位于染色体16p133，PKD2定位于染色体4q1323，但PKD3还未明确定位。多囊肾的基因突变85%90%是PKD1基因突变，PKD1基因目前已被克隆，其产物为多囊蛋白（或称多囊素）的氨基酸序列业已查清，它是一个相对分子质量约460的跨膜糖蛋白，有一个很大的细胞外N-末端和一个细胞内C-末端尾巴1。尽管多囊素的功能还未澄清，根据其细胞外的多个功能区，目前认为它发挥细胞与细胞、或细胞与间质之间的相互作用。本研究中，我们采用基因克隆多囊素多肽抗体或融合抗体，应用免疫组织化学方法，试探讨多囊素在多囊肾组织中的分布和多少，以便进一步推测

8、其功能。材料和方法一、材料8例多囊肾组织标本，均为女性，6例为肾移植前切除肾，2例为多囊肾腹痛切除肾，肾切除时患者已行血液透析1个月至14年不等。正常肾组织来自3例因肾肿瘤行肾切除的非肿瘤肾组织。两种兔抗鼠多囊素的合成肽单抗-抗pepPBP1 和抗pepPBP3以及一种多囊素融合蛋白单抗-抗fpAH4 由荷兰的D. Peter 教授赠送。fpAH4 和pepPBP1均位于目前认定的多囊素蛋白的细胞浆部分（即羧基端），pepPBP3多肽位于多囊素基因第24个外显子编码区（第2961-2975氨基酸），这三种抗体具有相同的免疫组织化学染色2。正常兔血清作为阴性对照。二、方法肾脏组织标本福尔马林固定

9、，石蜡包埋切片，切片厚度4 m。内源性过氧化酶用3%双氧水处理5分钟，内源性生物素活性用生物素抑制试剂合（Dako,Denmark）抑制。多囊素抗原恢复处理如下：切片浸入pH 6.0的枸橼酸缓冲液，微波炉处理4分钟，反复3次，原抗体适当稀释（1/2001/600），加到切片上，孵育一小时；免疫酶标染色应用LSAB2 过氧化酶试剂盒（Dako Denmark）,用3-氨基-9-乙基-卡巴砷作为显色底物；组织切片再用苏木素逆染。每例标本均做连续切片，分别用三种抗体和正常兔血清染色。为了确定囊肿的来源，3例多囊肾标本作了连续切片，应用花生刀豆素过氧化酶染色，分别鉴定远端、近端小管和集合管。抗fpAH

10、4融合蛋白抗体也采用过氧化酶法用于囊肿和肾小管多囊素表达的检测，刀豆素标记的过氧化酶采用二氨基苯乙啶为底物，显褐色。结果一、多囊素在正常肾组织的表达 在正常肾组织中三种抗体均有着染，三种抗体的免疫组织化学染色强度相近；而用正常兔血清处理的肾组织标本染色完全阴性。在肾小球，足细胞的着染主要在胞浆，靠近核周围，壁层上皮染色很弱且散在；系膜细胞和内皮细胞不着染。远端小管和集合管染色强阳性伴有细颗粒的胞浆着色，集合管的顶端和底部清楚着色，髓质部更为明显；近端小管弱染或阴性。二、多囊素在多囊肾组织的表达多囊素在多囊肾的表达比正常肾组织更为强染色。1.肾囊肿组织：在所研究的8例多囊肾组织，多囊素在囊衬里上

11、皮细胞的胞浆中检测到。这8例的少数囊上皮染色阴性。多囊素染色阳性的细胞占28%60%，大多数为50%（1），此外，即使在同一个囊肿的上皮细胞，6/8例肾组织囊肿细胞的着染存在差异性，某些阴性染色的囊上皮细胞比邻的细胞可以出现阳性染色；即染色存在异质性。2.非囊肿肾组织的多囊素表达（2）：组织化学染色所见约80%的非囊肿的肾小管表达多囊素，免疫染色呈颗粒状，在某些肾小管的细胞膜（顶端和基底部）染色增强，尤其在集合管。在着染的阳性细胞也存在差异性，阳性细胞的临近细胞也可有阴性细胞，增生肥大的肾小管细胞染色强阳性。在肾小球，上皮细胞染色阳性如同正常组织。1多囊素在多囊肾囊肿表达的免疫组织化学染色（光

12、镜×400）2多囊素在非囊肿肾组织的表达情况（光镜×400）讨论越来越多的研究表明，多囊素（或称多囊蛋白）是遗传性多囊肾病的重要因素，应用多囊素单克隆抗体或多克隆抗体检测多囊素在肾脏的表达已有报道3-5，各家的报道不尽相同，但都认为多囊素既可在多囊肾囊肿上皮表达，也可在正常成熟的肾脏表达。我们的研究表明，多囊素在正常肾小管上皮细胞表达，主要是在远端小管和集合管，而近端小管基本上是阴性的，本组的石蜡切片标本，多囊素的免疫组织化学染色主要是呈胞浆性，细胞膜染色或核周染色也可见到。一般认为，这与所用抗体（单抗或多抗）和组织处理（福尔马林或冰冻切片）有关；本组所用基因重组抗体是抗多

13、囊素的胞浆部分，其结果也相吻合。这些观察结果支持目前所认定的多囊素作用，即多囊素在细胞与细胞或细胞与基质之间发挥作用。我们的研究表明6，在培养的肾小管上皮细胞，应用共聚焦显微镜观察多囊素定位于单侧细胞膜，在细胞与细胞接触点探测到多囊素；晚近研究表明，双共聚焦显微镜证明多囊素与细胞骨架成分钙调素（cadherin）位于相同部位；另一组研究证实多囊素与整合素21和肌动蛋白细丝相结合，有趣的是整合素21存在于远端小管和集合管，而近端小管不存在。本组在成熟的足突细胞检测到多囊素，染色主要是细胞体，这与个别报道不同（他们在肾小球上皮细胞未检测到多囊素）。在这些细胞，多囊素的免疫组织化学染色可能与多囊素分

14、子结合到肌动蛋白细丝有关。我们研究所用的ADPKD组织，在囊肿上皮细胞的胞浆有多囊素的强阳性表达，表达阳性率达50%，但存在细胞间的差异性，甚至部分囊肿上皮细胞呈阴性，这种结果可能与囊肿的局部解剖起源有关；也就是说，阴性的囊肿可能来源于近端小管或包曼氏囊，不表达多囊素；而阳性的囊肿来源于远端小管或集合管，表达多囊素。另一种可能是阴性与阳性囊肿的不同支持这样一个观点：ADPKD的发生与PKD1基因“二次打击”理论相符；根据这种理论，阴性囊肿其PKD1基因改变导致整个蛋白丢失，而阳性囊肿细胞的基因改变导致一种无功能的多囊素形成。总之，多囊素的功能研究才刚刚开始，多囊素的结构分析表明，它是一个很大的

15、分子，具有五个细胞外蛋白分子片段区域，如乳糖结合区、LDL-A区、纤维连结蛋白结合区等；多囊素还具有免疫球蛋白重复区。多囊素可能具有复杂的功能，在细胞与细胞或细胞与基质之间发挥作用可能只是其功能的一部分。多囊素的抗体多种多样，不同节段的抗体可能出现不同的免疫组织化学结果。多囊素在非ADPKD肾囊肿上皮细胞的表达情况如何以及其作用，都是值得进一步研究的。作者单位：叶朝阳200003 上海，第二军医大学附属长征医院肾内科；Dominique DrozService de Nephrologie et INSERM U90,Hospital Necker,75015 Paris,France参考文献

16、1The international polycystic kidney disease consortium.Polycystic kidney disease: the complete structure of the PKD1 gene and its protein. Cell,1995，81:289-298.2Peters DJM, Spruit L, Klingel R, et al. Adult,fetal, and polycystic kidney disease 1 gene product. Lab Invest,1996， 75:221-230.3Van Adelsb

17、erg J,Chamberlain S, DAgati V. Polycystin expression is temporally and spatially regulated during renal development. Am J Physiol，1997，273：(Renal Physiol 41 ):F602-F609.4Geng L, Segal Y, Peissel B, et al. Identification and localization of polycystin, the PKD1 gene product. J Clin Invest，1996，98:2674-2682. 5Ward CJ, Turley H, Ong ACM, et al. Polycystin, the polycystic kidney disease 1 protein, is expressed by epithelial cells in fetal, adult, and polycystic kidney. Proc Natl Acad Sci