枸杞多糖分离纯化及性质研究

1、第 25卷 第 3期2008年 6月 黑 龙 江 大 学 自 然 科 学 学 报 JOURNAL OF NAT URAL SC I E NCE OF HE I L ONGJ I A NG UN I V ERSI TY Vol 125No 13June, 2008枸杞多糖分离纯化及性质研究张 晶 1, 2, 韩喜江 1, 李艳波 2(1. 哈尔滨工业大学 化学系 , 哈尔滨 150001; 2. 哈尔滨学院 生化学院 , 哈尔滨 150080摘 要 :对东北枸杞中提取的多糖 , 通过 DEAE -cellul ose (OH - 色谱柱和 Sephadex G -100凝胶色谱柱进行了分离纯化

2、, 通过凝胶色谱和液相色谱对其纯度进行了鉴定 , 并通过红外光谱初步 分析了其基团构成 。关键词 :枸杞多糖 ; 分离纯化 ; 纯度鉴定中图分类号 :R28412, TS244文献标志码 :A 文章编号 :1001-7011(2008 03-0377-04收稿日期 :2008-01-16作者简介 :张 晶 (1973- , 女 , 实验师 , 硕士 , 主要研究方向 :应用化学 、 食品化学0 引 言枸杞是一种食药两用植物 , 。 , 其 中有关枸杞多糖的化学 、 药理与临床研究十分瞩目 , 、 抗癌 、 防衰老 、 抗疲劳 、 降血压 、 降血糖 、 2功能 , 因此 , 1 111 材料与

3、仪器牡丹江地区枸杞子 ; 其它试剂均为分析纯 。 自动部分收集器 , 台式干燥箱 , 紫外分光光度计 , Perkin -El 2mer 红外光谱仪 , Aglilent 1100液相色谱仪等 。112 枸杞多糖提取称取 100g 枸杞子 60 烘干 , 放置干燥器 18h 后粉碎 , 称取 10g 干燥的枸杞粉 , 用氯仿 -甲醇 (2 1 300mL, 用索氏回流装置于 60 回流脱脂 。 残渣风干后 , 加入适量水 , 在 100 , 料水比 1 15条件下水浴提 取 4h, 抽滤 , 将滤液蒸发浓缩为原体积的 1/4后 , 将浓缩液滴入 3倍体积的 95%乙醇中 , 静置 , 抽滤 ,

4、 固形物分别用 95%乙醇 、 无水乙醇 、 丙酮洗涤 , 水浴加热干燥得枸杞粗多糖 4。113 枸杞多糖分离纯化11311 DEAE -cellul ose (OH - 色谱柱层析将分离提取的枸杞粗多糖 110g 溶于水 , 上 DEAE -cellul ose (OH - 色谱柱 , 梯度洗脱法洗脱各级分 , 洗脱液分别为蒸馏水 、 011mo1 L -1, 0125mol L -1和 015mol L -1NaCl, 011mol L -1Na OH 各 100mL, 流速为 30滴每分钟 , 自动部分收集器收集洗脱液 , 将收集到的样品溶液分别在 280nm 波长下比色 , 然后用硫酸

5、一蒽酮法测定总糖含量 。 以试管数目为横坐标 , 以吸光度为纵坐标作 DE AE -cellul ose (OH - 色谱柱洗脱曲线图 。 分别合并各主峰溶液 , 浓缩 , 流水透析 , 冷冻干燥 , 得 LBP -1, LBP -2, LBP -3和 LBP -4. 11312 Sephadex G -100凝胶色谱柱 。收集多糖含量最多的组分 , 进行凝胶色谱分离 。 流速为 013mL m in -1, 每支试管接收 3mL 洗脱液 , 硫酸一蒽酮法检测多糖洗脱状况 。 以洗脱管数为横坐标 , 吸光值为纵坐标作流出曲线 , 合并主峰溶液 , 浓缩 , 流 水透析 , 冷冻干燥。 114

6、L BP 纯度鉴定 多糖的纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量 , 多糖纯度判断可根据糖基的摩尔比是否恒定 , 电泳是否呈一条带 , 柱层析是否呈现一个峰来进行 5。11411 凝胶层析法称取 2mg LBP 样品 , 溶于 1mL 蒸馏水中 , 上 Sephadex G -100凝胶色谱柱 , 重蒸水洗脱 , 流速为013mL m in -1, 每支试管接收 3mL 洗脱液 , 硫酸一蒽酮法检测多糖洗脱状况 。 以洗脱管数为横坐标 , 吸光值为纵坐标作流出曲线 。11412 高效液相色谱法 (HP LC 鉴定仪器 Aglilent1100液相色谱仪 ; 色谱柱 双柱串联 79911GF

7、-083、 79911GF -084色谱柱 ;监测器 示差 R I D 监测器 ; 流动相 蒸馏水 ; 流速 1mL m in -1; 内部温度 30 ; 柱温 25 .115 L BP -4红外光谱测定6-8称取 LBP 12mg, 加入 100mg K B r 充分研磨 , 压片 , 用红外光谱仪于 4000650c m -1波长范围内扫描 。116 L BP 部分理化性质的测定配制一定浓度的枸杞多糖溶液 , 分别进行硫酸 -蒽酮 、 考马斯亮蓝染色反应 、 碘 -碘化钾反应以及菲林试验 , 检测是否含有多糖 、 蛋白质 、 淀粉以及单糖 9-10。2 结果与分析211 D EAE -ce

8、llulose(O H -色谱柱分级结果 由图 1, 2, 3, 4可看出 , 、 011mo1 L -1的 NaCl及 0125mo1 L -1NaCl 洗 脱出现一个峰 , 011mol -, 依次命名为 LBP -1, LBP -2,LBP -3和 LBP -4, 其中 LBP -, 真空冻干 , 为下一步纯化备用 。 873 黑 龙 江 大 学 自 然 科 学 学 报 第 25卷 212 L BP -4Sephadex G -100凝胶色谱柱分级结果由图 5可以看出 , LBP -4经 Sephadex G -100凝胶色谱柱分级共收集 2个组分 , 依次命名为 LBP -I 和 LB

9、P -II, 由于 LBP -II 含量较少 , 所以本实验主要对 LBP -I 的性质进行研究 。213 L BP -I 纯度鉴定结果由图 6可见 , LBP -I 经过 Sephadex G -100凝胶色谱柱层析 , -I 为分子量 分布均一的枸杞多糖组分 。由图 7, 说明该组 分是纯度较高的多糖 。214 L BP -I 红外光谱分析从图 8红外光谱可推测 :38003300c m -1处的宽峰是由 O -H 伸缩振动和 N -H 伸缩振动引起的 ;20001500c m -1吸收峰是由 -COO 的 C =O及 NH 2对称伸缩振动引起的 ; 1240c m -1吸收峰是由 -CO

10、OH的 -OH 变角振动引起的 , 同时 1110c m -1吸收峰是仲碳 -OH 的 O -H 变角振动引起的 ; 1050c m -1和 1020c m -1吸收峰是伯碳 -OH 的 O -H 变角振动引起的 , 780c m -1吸收峰表明 -D -吡喃葡萄糖环的存在 。因 此 , 可以推断 LBP 中含有 -OH 、 -COOH 、 -NH 2或 -NH -。215 L BP -I 紫外光谱分析多糖组分 LBP -I 的紫外光谱分析结果如图 9所示 , LBP -I 在 260nm 处没有吸收峰 , 表明枸杞多糖不 含核酸 ; 在 280n m 处未见吸收峰 , 表明枸杞多糖不含蛋白质

11、 。216 L BP 部分理化性质分析硫酸 -蒽酮反应呈阳性 , 考马斯亮蓝反应呈阴性 , 菲林试剂反应呈阴性 , 碘 -碘化钾反应呈阴性 , 所以 , 各级分为不含蛋白质 、 淀粉和还原糖的酸性多糖 。 973 第 3期 张 晶等 : 枸杞多糖分离纯化及性质研究3 结 论多糖提取工艺以及分离 、 纯化方法决定了产品的纯度 , 另外枸杞子产地的不同也可能对研究结果有影 响 。 本试验经 DEAE -纤维素柱分离纯化 , 检测到枸杞多糖共有 4种多糖组分 , -2、 LP B -3、 LBP -4, 其中 LBP -4含量最多 , 经过 Sephadex G -100糖 , 但从组成上看它们存在

12、着微观不均一性 , , -OH 、 -COOH 、 -NH 2-或 -NH -基团 。 、 淀粉和还原糖的酸性 多糖 。1 薛立文 , . J .广东微量元素科学 , 2000, (6 :189-192.2 王汉中 , 张 . J .营养学报 , 2002, 24(2 :189-192.3 袁振林 . 枸杞多糖的提取及含量和分子量分布的测定 J .广东化工 , 2003, (3 :43-45.4 张 晶 , 韩喜江 . 东北枸杞多糖分离工艺优化 J .黑龙江大学自然科学学报 , 2007, (6 :770-772.5 李 津 . 生物制药设备和分离纯化技术 M.北京 :化学工业出版社 , 20

13、03, (6 :230-232.6 Ferreira D, Barr os A, Coi m bra M A, et . al . U se of FT -I R s pectr oscopy t o f ol ow the effect of p r ocessing in cell wall polysaccharide elctracts of asun -dried pear J .Carbohydrate Poly mers, 2001, 45(2 :175-182.7 李润卿 . 有机结构波谱分析 M.天津 :天津大学出版社 , 2002:48-144.8 Marcela Cern

14、a, Jana Cop ikova Ant oni o S . Parr os, et . al . U se of FT -I R s pectr oscopy as a t ool for the analysis of polysaccharide foodadditivesJ .Carbohydrate Poly mers, 2003, 51(4 :383-389.9 姚新生 . 天然药物化学 M.北京 :人民卫生出版社 , 2006:6; 71-77.10 陈钧辉 . 生物化学实验 M.北京 :科学出版社 , 2003:4; 25-35.Stud i es on isol a ti

15、on, pur i f i ca ti on and properti es fro mwolfberry polys acchar i deZhang J ing 1, 2, Han Xijiang 1, L i Yanbo2(1. Depart m ent of App lied Chem istry of Harbin I nstitute of Technol ogy, Heil ongjiang, Harbin 150001, China; 2. L ife Sciences and Che m istry College ofHarbin University, Harbin 150080, China Abstract:The polysaccharide in the northeast of Chinese wolfberry was extracted . The the p r oduct was s perated andpurified by DEAE -cellul ose (OH - colu mn and Sephadex G -100gel column, and its purity was identifie