lisiman实验二血清蛋白的盐析及清球比值测定ppt课件

1、医学生物化学与分子生物学实验教程 第三篇第三篇 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验第二十一章第二十一章 综合性实验综合性实验实验实验3 3 血清蛋白的盐析及清血清蛋白的盐析及清/ / 球比值测定球比值测定 P179P179 实实 验验 二二 血清蛋白的盐析及清血清蛋白的盐析及清/ 球比值测定球比值测定掌握盐析的原理和方法。掌握盐析的原理和方法。掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。了解血清蛋白质定量测定的临床意义。了解血清蛋白质定量测定的临床意义。 【实验目的】【实验目的】 Experimental Objectives (Experim

2、ental Principles)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的呈色反响蛋白质的呈色反响考马斯亮兰染色法考马斯亮兰染色法 【实验原理【实验原理 】盐析盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。1 1蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的要素蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的要素电荷电荷(同种电荷相斥同种电荷相斥水化膜隔离水化膜隔离Pr+Pr+中性盐破坏了这两个稳定性要素，使蛋白质沉淀。中性盐破坏了这两个稳定性要素，使蛋白质沉淀。 【实验原理【实验原理 】 中性盐参与蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和中性盐参与蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是

3、蛋白质分子周围的水化膜层减弱力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消逝。同时，中性盐参与蛋白质溶液后，由于离乃至消逝。同时，中性盐参与蛋白质溶液后，由于离子强度发生改动，蛋白质外表电荷大量被中和，更加子强度发生改动，蛋白质外表电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉淀蛋白质的方法还有哪些？ 【实验原理【实验原理 】o 蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。o 沉淀的缘由沉淀的缘由: :破坏水化膜破坏水化膜; ;改动蛋白质外表改动蛋白质外表基团的解离。基团的解离。o 沉淀的方法

4、沉淀的方法: :盐析法盐析法; ;有机溶剂法有机溶剂法; ;重金属盐重金属盐沉淀法沉淀法; ;生物碱试剂沉淀法；加热沉淀。生物碱试剂沉淀法；加热沉淀。 【实验原理【实验原理 】o 正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分约分约60%60%以上，其他为球蛋白，两者比例以上，其他为球蛋白，两者比例为为1.5-2.51.5-2.5：1 1。兔血清清球比。兔血清清球比0.6-1.50.6-1.5：1 1。o 清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清中参与硫酸铵至半饱和时，球蛋白可清中参与硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白坚持溶解形

5、状，被完全沉淀，而清蛋白坚持溶解形状，依此可将清蛋白和球蛋白分别。依此可将清蛋白和球蛋白分别。 【实验原理【实验原理 】 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250Coomassie brilliant blueCoomassie brilliant blue与蛋白质中的碱与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色。此时蛋白质性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色。此时蛋白质- -色素结色素结合物在合物在595nm595nm波长下有最大光吸收。常用于快速定量分析。波长下有最大光吸收。常用于快速定量分析。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250【仪器试剂】【仪器试剂】血清、饱和硫酸铵溶液

6、、规范蛋白血清、饱和硫酸铵溶液、规范蛋白溶液、溶液、 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250 722S型分光光度计；型分光光度计；规范曲线的绘制及规范曲线法规范曲线的绘制及规范曲线法 1 2 3 4 5 样品标液 C1 C2 C3 C4 C5 CX A A1 A2 A3 A4 A5 AXACXAX1.1.规范曲线制造规范曲线制造1 1蛋白规范液的倍比稀释：蛋白规范液的倍比稀释：0.50.50.250.250.1250.125蛋白质终浓度蛋白质终浓度mg/mlmg/ml 【操【操 作作 步步 骤】骤】Operating Procedure2 2规范曲线的制造规范曲线的制造管管 号号0 01 12 23

7、34 4考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250 G-250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 0.9% NaCl 0.9% NaCl 100l 100l 对应加入倍比对应加入倍比稀释的稀释的蛋白标准液蛋白标准液 100l 100l 100l 100l 100l 100l 100l 100l 蛋白质含量蛋白质含量（gg） 0 012.512.525255050100100A A595nm595nm 【操【操 作作 步步 骤】骤】 Operating Procedure一一 血清蛋白的盐析血清蛋白的盐析 取取1.5 ml EP管管1支支+0.5 ml血清血清滴

8、加饱和硫酸铵滴加饱和硫酸铵0.5 ml血清已被血清已被稀释了稀释了2倍，边加边混匀倍，边加边混匀室温静置室温静置5分钟后，分钟后，10000rpm，离心，离心2分钟分钟转移上清至另一支转移上清至另一支EP管内备用，此为管内备用，此为盐析上清。盐析上清。( (二二).).血清中蛋白质浓度的测定血清中蛋白质浓度的测定1 1血清样品的稀释：取血清样品的稀释：取2 2支支1.5 ml EP1.5 ml EP管，管， 标志标志1 1号、号、2 2号，按下表稀释号，按下表稀释. .留留2 2号管备用。号管备用。总蛋白2 2盐析上清清蛋白的稀释：取盐析上清清蛋白的稀释：取2 2支支1.5 ml EP1.5

9、ml EP管管 标志标志3 3号、号、4 4号，按下表稀释号，按下表稀释盐析上清盐析上清（清蛋白）（清蛋白）清蛋白3 3血清中蛋白质浓度的测定：取血清中蛋白质浓度的测定：取2 2支大试管，支大试管， 标志标志5 5号、号、6 6号，按下表参与试剂。号，按下表参与试剂。 取样后充分混合，放置取样后充分混合，放置2min2min后后, ,记录记录A595nmA595nm，并经过规范曲线查得，并经过规范曲线查得待测样品中蛋白质浓度。待测样品中蛋白质浓度。清蛋白总蛋白三绘制规范曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白三绘制规范曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白 浓度及清浓度及清/ /球比值。球比值。血清蛋白总蛋白浓

10、度血清蛋白总蛋白浓度 = = 图示值图示值200200稀释倍数稀释倍数= = mg/mlmg/ml盐析上清清蛋白浓度盐析上清清蛋白浓度 = = 图示值图示值200200稀释倍数稀释倍数= = mg/mlmg/ml计算清计算清/ /球比值球比值: : 清蛋白的浓度清蛋白的浓度/ /总蛋白的浓度总蛋白的浓度- -清蛋白的浓度清蛋白的浓度 = = 思索题思索题(Questions)(Questions)蛋白质分别纯化的方法？蛋白质分别纯化的方法？凯氏定氮法凯氏定氮法双缩脲法双缩脲法(Biuret)(Biuret)紫外吸收法紫外吸收法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法BradfordBradfordFolinF

11、olin酚试剂法酚试剂法 血清蛋白质测定的临床意义肝脏是人体内的最大腺体肝脏是人体内的最大腺体代谢功能代谢功能9090蛋白、糖、脂、胆汁酸、胆蛋白、糖、脂、胆汁酸、胆红素、激素灭活及部分金属红素、激素灭活及部分金属生物转化功能氧化、复原、水解、结合生物转化功能氧化、复原、水解、结合分泌和排泄功能分泌和排泄功能 1、血液生化检验肝功检查 肝脏的合胜利能：总蛋白TP、清蛋白ALB、球蛋白GLO 肝细胞受损的情况：谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST 肝细胞的代谢功能：直接胆红素DBIL、总胆红素TBIL2、病毒标志检测乙肝五项。肝脏病的实验室检查主要包括两个肝脏病的实验室检查主要包括两个方面：方面：

12、正常成人血清：正常成人血清： 总蛋白总蛋白 60-80g 60-80gL L 清蛋白清蛋白 40-55g 40-55gL L 球蛋白球蛋白 20-30g 20-30gL L A AG 1.5-2.5 : 1G 1.5-2.5 : 1 血清总蛋白血清总蛋白 Serum total protein；TP 静脉采血静脉采血2ml，不抗凝，分别血清进展测，不抗凝，分别血清进展测定。定。 血清总蛋白包括白蛋白及球蛋白。血清总蛋白包括白蛋白及球蛋白。 【正常参考值】【正常参考值】 6080 g/L【异常结果分析】【异常结果分析】总蛋白增高：总蛋白增高： 急性失水所致血液浓缩，如严重急性失水所致血液浓缩，如

13、严重呕吐，腹泻，大量出汗。呕吐，腹泻，大量出汗。 某些球蛋白增多疾病，如多发性某些球蛋白增多疾病，如多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症等骨髓瘤，巨球蛋白血症等总蛋白降低：总蛋白降低： 病因根本同清蛋白降低病因根本同清蛋白降低 清蛋白清蛋白AlbuminAlbumin；ALBALB 静脉采血静脉采血2ml,2ml,不抗凝，分别血清进展不抗凝，分别血清进展测定。测定。 清蛋白几乎都由肝脏合成，它是血浆清蛋白几乎都由肝脏合成，它是血浆中的主要蛋白成分，具有结合，转运其他中的主要蛋白成分，具有结合，转运其他分子、维持血浆胶体浸透压等重要作用。分子、维持血浆胶体浸透压等重要作用。 【正常参考值】【正常参考值】

14、40 40 55 g/L 55 g/L 【异常结果分析】【异常结果分析】 清蛋白降低：清蛋白降低： 肝细胞病变：慢性肝炎，肝硬化，肝坏肝细胞病变：慢性肝炎，肝硬化，肝坏死，肝癌，肝功能严死，肝癌，肝功能严 重受损等。重受损等。 蛋白丧失过多：肾病综合征，大面积烧蛋白丧失过多：肾病综合征，大面积烧伤，浆膜渗出性损害等伤，浆膜渗出性损害等 蛋白摄入缺乏：如营养不良，慢性腹泻，蛋白摄入缺乏：如营养不良，慢性腹泻，吸收不良综合征等。吸收不良综合征等。 慢性耗费性疾病：如恶性肿瘤，结核病，慢性耗费性疾病：如恶性肿瘤，结核病，甲状腺功能亢进，甲状腺功能亢进， 长期慢性发热等。长期慢性发热等。清蛋白球蛋白比值清蛋白球蛋白比值AG静脉采血静脉采血2ml，不抗凝，分别血清，不抗凝，分别血清进展测定进展测定【正常参考值】【正常参考值】1.52.5【异常结果分析】【异常结果分析】AG比值比值1提示有慢性肝本提示有慢性肝本质性损害。质性损害。动态察看动态察看AG比值可提示病情比值可提示病情的开展和估计预的开展和估计预后，病情恶化时清蛋白逐渐减少，后，病情恶化时清蛋白逐渐减少，AG比值下比值下降，降，AG比值继续倒置表示预比值继续倒置表示预后较差。后较差。可以是清蛋白降低或球蛋白增高。可以是清蛋白降低或球