基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展

1、分子植物育种，2009年，第7卷，第1期，第130136页Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.1, 130136专题介绍Review基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展张征锋1肖本泽2*1华中师范大学遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室, 武汉, 430079; 2华中农业大学植物科学与技术学院, 武汉, 430070*通讯作者, benzexiao摘要各种序列数据库的迅猛增长与生物信息软件的不断开发使基于序列资源的标记开发更加便捷，各类分子生物学技术的涌现及高通量检测平台的建设为实验室开发分子标记提供了强有力的技术支持。本文从生物

2、信息学角度概述了SNP 、SSR 等分子标记开发的方法、特点及应用现状，并介绍了利用分子生物技术开发SSR 、SRAP 、TRAP 标记的手段及从RAPD 、AFLP 等标记向单位点特异性PCR 标记(如SCAR 、CAPS 、dCAPS 等 转化的进展。最后，对不同植物标记开发策略的选择及以上各种技术在功能标记开发中的应用前景作了展望。关键词标记开发, 生物信息学, 生物技术, 功能标记The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioin-formatics and BiotechnologyZhang

3、Zhengfeng 1Xiao Benze 2*1Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, Central China Normal University, Wuhan, 430079; 2College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070*Corresponding author, benzexiaoAbstract The genome sequencing and exp

4、ressed sequenced tag (ESTprojects generated a vast amount of se-quences data. Simultaneously, the increasing bioinformatics software facilitates the development of molecular mark-ers. Additionally, to develop molecular markers in laboratory will benefit from the advanced biotechnology and con-struct

5、ion of batch of operation systems. The methods, characteristics and corresponding application of developing SNP and SSR based on bioinformatics and developing SSR, STAP, TRAP on biotechnology were reviewed. The progress of conversion of RAPD and AFLP to single-locus specific PCR markers were also pr

6、esented. Finally, how to select suitable technique for different plants and develop functional markers are elucidated. Keywords Marker-developing, Bioinformatics, Biotechnology, Functional marker基金项目：本项目由国家自然科学基金(30800680资助分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的遗传标记形式。自从1980年Botstein 等首次提出用RFLP 作为遗传标记构建遗传连锁

7、图谱以来，分子标记技术及其应用研究日新月异，相继出现了二十多种DNA 分子标记方法，构成了分别以RFLP 、SSR 及SNP 为代表的三代分子标记。按其技术原理，可分为三大类：第一类是以分子杂交为基础的标记技术，主要是RFLP 。第二类是以PCR 反应为基础的一系列分子标记技术，如RAPD 、SCAR 、STS 和SSR 等。第三类是以酶切和PCR 为基础的分子标记技术，主要有AFLP 和CAPS 等(表1 。近20年来分子标记对植物遗传和育种研究的发展起到了革命性的作用，其应用涉及到重要性状基因或QTL 的定位、遗传图谱的构建、种质资源遗传关系的确定、杂种优势群的划分、比较图谱分析、分子标记

8、辅助选择及图位克隆等多个领域。本文重点介绍利用生物信息学及分子生物学手段开发分子标记的研究进展。1利用数据库序列信息和生物信息学手段开发新的分子标记随着表达序列标签EST 计划的实施及水稻等模式作物中基因及全长cDNA 的克隆，大量的DNA 序列信息被储存在公共数据库。另外拟南芥、水稻等基因组测序工作的完成及其它一些重要生物基因组测序工作的相继开展(Meinkeet al., 1998; Goff et al., 2002; Yu et al., 2002; Timmermans et al., 2004 ，为利用生物信息学手段开发分子标记提供了大量有益的信息。通过利用计算机程序，可以从Gen

9、Bank 等数据库中将这些序列下载并识别出其中的SSR 、SNP 等潜在的多态性位点。1.1SNP 的生物信息学开发SNP 是指基因组内DNA 中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化(Lander,1996 。在遗传学分析中，SNP 作为一种遗传标记得以广泛应用，主要源于这几个特点：(1密度高；(2遗传稳定性高；(3易于实现分析的自动化。目前SNP 的检测技术有多种，DNA 芯片由于具有高度集成化、并行化、多样化、微型化等优点而成为最理想的SNP 检测技术(Ngand Liu, 2006 。生物信息学的SNP 挖掘方法主要是基于“冗余”数据库。国际主要的核酸数据库允许不同的机构

10、在任意时间向数据库中提交各种序列，由此造成某一特定区段的序列在数据库中存在多个拷贝，它们可能来源于同一物种不同品系、同种材料不同组织发育时期等，之间存在多态性。为SNP 的开发提供了丰富的资源。目前应用EST 数据库已在人类(Garget al., 1999; Picoult-Newberg et al., 1999; Brumfield et al., 2003 ，拟南芥(Schmidet al., 2003 、玉米(Usecheet al., 2001; Batley et al., 2003 等许多生物中进行SNP 的开发，在如内含子区、3' 非翻译区、BAC 末端序列等非编码区

11、的序列是发掘SNP 的很好的资源而且其多态性的检测频率是编码区的表1几种常用标记系统Table 1Some universal systems of molecular markers 标记类型Types of markersSinge Nucleotide Polymorphism Coding SNP, non-coding SNPSimple Sequence Repeat, Microsatellite EST-SSRsRestriction Fragment Length Polymorphism Random Amplified Polymorphic DNA Amplified

12、Fragment Length Polymorphism Sequence Characterized Amplified Regions Cleaved Amplified Polymorphic SequenceDerived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Inter-simple sequence repeatSequence-Related Amplified Polymorphism Target Region Amplified Polymorphism简写Abbreviations SNPcSNP, ncSNP SSR cSSR R

13、FLP RAPD AFLP SCAR CAPS dCAPS ISSR SRAP TRAP参考文献ReferencesLander, 1996Lopez et al., 2005Tautz, 1989Varshney et al., 2005Botstein et al., 1980Williams et al., 1990Vos et al., 1995Paran and Michelmore, 1993Konieczny and Ausubel, 1993Neff et al., 1998Zietkiewicz et al., 1994Li and Quiros, 2001Hu and Vi

14、ck, 20033倍(Zhuet al., 2003 。Lopez 等(2005对木薯分别利用生物信息学方法对EST 序列数据库及PCR 方法对非编码区序列在5个栽培种中进行SNP 分析，结果表明：EST 序列中509bp 一个SNP ；而在3'EST 和BAC 末端序列中62bp 出现一个SNP 。Liu 等(2007通过对籼稻品种广来10096个全长cDNA 的测序并与基因组数据库粳稻的序列比对发现，由于SNP 、插入缺失等序列多态性而引起45.8%的氨基酸水平替换。由于SNP 的特点，利用它可以构建出非常精细的遗传图谱；在GenBank (

15、的SNP 数据库中，400万的水稻SNP 已被定位到水稻基因组(Lianget al., 2008 。1.2微卫星标记的生物信息学开发SSR 标记因其重现性好、可检测位点多、共显性且均匀覆盖整个基因组等优点成为育种家和遗传学家研究的有效工具。由序列信息开发SSR 主要从BAC 末端、基因间序列等非编码序列及从EST 等编码序列中开发，前者称为基因组SSR ，具有更高的多态性而在区分关系相近的基因型时更加有效；后者称为EST-SSRs ，来自转录本的特性赋予了其更高的价值：通过同源性检索可以推断其功能；可用于对自然群体和种质收集的功能多样性分析；高水平的可转移性使之在比较定位和进化研究中可作为锚

16、定标记。1.2.1EST-SSRs 的识别、频率及分布Morgante 与Olivieri 早在1993年就开发对植物EST-SSRs 进行鉴定。然而当时可利用的公共序列数据非常有限(<5000kb 。在单子叶植物及双子叶植物中鉴定率分别只达到64.6kb 和21.2kb 一个EST-SSRs 。随后，EST 计划的实施产生了大量序列基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioinformatics and Biotechnology131分子植物

17、育种Molecular Plant B推动了基因内SSRs 的识别。Varshney 等(2005估计了大麦75.2Mb 、玉米54.7Mb 、水稻43.9Mb 、黑麦3.7Mb 、高粱41.6Mb 和小麦37.5Mb 的表达区域SSR 密度，平均覆盖率为6.0kb 一个SSR 。然而，Morgante 等(2002在水稻、玉米和小麦中报道了分别为2.1kb 、1.1kb 、1.3kb 的更高的SSRs 频率。值得注意的是由于在识别SSRs 的标准上的差异导致SSRs 的频率及不同长度、不同重复单位的出现频率在不同研究中差异较大。最常见的

18、为3个核苷形成的重复(trinucleotiderepeats, TNRs ，其次是2个核苷(dinucleotiderepeats, DNRs 或4个核苷形成的重复(tetranucleotiderepeats, TTNRs 。Varshney 等(2005研究发现在禾本科作物EST 数据库中TNR 出现频率最高，为54%78%；DNR 和TTNR 则分别为17.1%40.4%和3%6%。不同重复模体的频率和分布在不同研究中均有差异：小麦中TNRs 变化为49%83%，DNRs 与TTNRs 的出现频率在不同研究中则变化不大(Kantetyet al., 2002; Morgante et

19、al., 2002 。1.2.2多态性水平由于转录区的DNA 序列保守性较强，EST-SSRs 的多态性一般低于基因组SSR 。然而最近在对猕猴桃EST-SSRs 进行发掘并定位时发现，其中93.5%具有多态性而且在种内杂交产生的群体中有分离。另外，3' 非翻译区EST-SSRs 的多态生检测率高于5' 非翻译区。Scott 等(2000发现来自不同区域的EST-SSRs 的其多态性有所差异，3'UTR 的EST-SSRs 在栽培种间具有最高的多态性；5'UTR 的EST-SSRs 在不同的种间具有最高的多态性；而编码区的EST-SSRs 在不同的属间具有最高的

20、多态性。胥猛和李火根(2008通过对6520条鹅掌楸EST 序列进行检索，在364条ESTs 中发现394个SSRs ，鹅掌楸EST-SSRs 平均密度为每8.5kb 含有1个SSR ；其中二核苷酸重复单元的SSRs 类型最多，占总数的61.9%。利用SSR-ESTs 序列共设计176对EST-SSR 引物，扩增后多态性引物占36.9%。这批EST-SSR 引物具有较高通用性，85%在中国马褂木中有扩增，54%在白玉兰中有扩增。EST-SSRs 的开发对于比较作图来讲非常重要。一个可以在不同的物种中扩增出同源位点的EST-SSRs 引物数据库对育种家和遗传学家来讲非常有用，尤其是对小而资金不足

21、的作物更是如此，因为它们位于基因编码区，具有很强的保守性。2利用分子生物学实验技术开发新的分子标记从实验室开发新的分子标记方式来讲可将其分为3类：第一种包括RAPD 、SSR 、AFLP 、SRAP 等，因其具有共同点，即不需要预知DNA 序列信息、检测位点随机性强而将其称为非特异性标记；第二种主要包括FLP 、SSR 、SCAR 、CAPS 等，其特点是预先需了解DNA 序列信息以制备探针或设计引物、检测位点特异性高，在此将其称为特异性标记，它们的开发主要从感兴趣的非特异性标记转换而来；另一种则是根据已知序列设计特异的单侧引物与另一侧用非特异性引物组合扩增，特将此类标记称为中间型标记，如TR

22、AP 标记。2.1新型非特异标记SRAP 的研究相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplified polymorphism, SRAP 由美国加州大学Li 与Quiros 博士于2001年提出。引物设计是SRAP 分析的核心。SRAP 标记分析共有两套引物。在一组正向SRAP 引物中使用“CCGG ”序列，其目的是使之特异结合ORFs 区域中的外显子；反向引物的3' 端含有核心AATT ，其目的是为了提高多态性。研究表明外显子一般处于富含GC 区域，如拟南芥2和4号染色体的全序列中，外显子CG 比例分别为46.5%和44.08%，而内含子中则为32.1%和33.0

23、8%(Linet al., 1999 。由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含AT 的区域序列通常见于启动子和内含子(Liand Quiros, 2001 ，这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP 多态性标记。Li 和Quiros (2001利用同一引物组合，从甘蓝类不同作物中(包括花椰菜、表花菜等 可获得多个SRAP 标记，且在不同实验中多态性条带重复性极好；同时，在花椰菜DH 植株与青花菜杂交产生的F 2群体cDNA 中检测到281个多态性SRAP 标记，构建了由cDNA-SRAP 标记组成的转录图谱。2.2新型中间型标记TRAP 的研究靶位区域扩增多

24、态性(targetregion amplified poly-morphism, TRAP 标记由美国农业部北方作物科学实验室Hu 与Vick 于2003年提出。SRAP 使用两个任意引物；而TRAP 是使用任意引物与长度为1620个核甘酸的固定引物，任意引物与SRAP 所用的一样，为一段以富含AT 或GC 为核心、可与内含子或外显子区配对的随机序列；固定引物以公用数据库中的靶EST 序列设计而来。Hu 与Vick (2003设计了与向日葵EST 数据库中编码富含亮氨酸重复(LRR类似蛋白序列配对的固定引物，利用TRAP 标记分析，对向日葵属16个野生种及2个杂交种的遗传变异性进行评估。结果1

25、32基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioinformatics and Biotechnology表明TRAP 标记可用于评估向日葵的遗传多样性分析，聚类结果与经典分类相一致；其中一个TRAP 引物结合到与抗病性有关的基因序列。张丽等(2008利用24对TRAP 引物对16个玉米自交系进行了遗传多样性分析, 共扩增出475条具多态性的谱带，平均多态性信息量为0.9044，平均多态性比率为84.8%。对16个自交系类群划分结果与系谱分析结果基本一致

26、。表明TRAP 技术在遗传多样性分析别和重要目的农艺性状的基因定位方面存在广泛的应用前景。3特异性分子标记的研究3.1SSR 分子标记的开发策略传统的SSR 分子标记开发需先制备基因组DNA 片段，筛选较小DNA 片段，连接载体并转化大肠杆菌，构建基因组文库。用人工合成带放射性同位素或非放射性标记的SSR 探针进行文库筛选。对阳性克隆进行测序，根据SSR 重复的侧翼序列信息设计引物。这种方法工作量大，近年来有些学者相继提出一系列高效的SSR 标记开发策略。3.1.1基于RAPD 富集SSR为避免基因组文库构建和筛选阳性克隆，Cifarelli 等(1995提出利用SSR 与随机扩增产物杂交的开

27、发策略，并在糖用甜菜、橄榄、向日葵上成功分离出SSR 。其主要程序是：先进行RAPD 扩增，琼脂糖凝胶电泳分离扩增条带。再将RAPD 扩增产物转到硝酸纤维膜上，并用地高辛标记的特异SSR 探针与扩增产物进行杂交。对阳性条带进行回收、克隆、测序。序列分析表明，两端为RAPD 引物，内部包含SSR 序列。3.1.2基于ISSR-PCR 的SSR 分离ISSR 标记是与基于RAPD 的分离策略相比，ISSR-PCR 基础上的分离方法同样避免了文库的构建与筛选，而且避免了SSR 富集的随机性，从而大大缩短了时间，降低了研究费用。Fisher 等(1996年设计5' KKVRVRV(CT63&#

28、39; 为简并引物对基因组DNA 进行PCR 扩增。对简并引物多基因座PCR 产物克隆，随机选取8个克隆测序，结果表明，各SSR 相异，且序列两侧均有SSR 存在，重复数612不等。该方法的优点在于不仅可方便快捷建立SSR 富集文库，而且只需设计合成SSR 一侧引物序列，就可与原简并引物配合使用，省去了设计合成SSR 另一侧引物的费用。3.1.3建立序列标签文库获得SSR 引物序列Hayden 和Sharp (2001通过建立序列标签文库富集SSR 。该方法结合ISSR-PCR 扩增、选择性杂交、酶切、连接等技术，将从基因组中筛选捕获的多个含SSR 一侧保守序列的片段连接后克隆到质粒载体中，建

29、成序列标签库。该序列标签库中每个克隆都含有多个SSR 一侧保守序列，可用于设计SSR 引物，大大提高了工作效率。另外，还有基于引物延伸(Ostranderet al., 1992 、基于选择杂交(Karagyozovet al., 1993 等方法，这些方法各有优缺点，其相应技术原理可参考相应文献，这里不再一一赘述。相比之下，基于ISSR-PCR 扩增的富集方法所需设备简单，技术成熟，适合于多数实验室开展工作。3.2利用RFLP 和RAPD 转化为特异性的PCR 标记Causse 等(1994构建了包含800个RFLP 标记的水稻遗传连锁图。但该技术检测步骤较多，周期长，检出的多态性较少。基于

30、PCR 技术的RAPD 分子标记多态性检出率高，操作简便、快速，但对反应条件极为敏感，重演性相对较差(Welshand McClelland, 1991 。通过对基因组DNA 克隆的双向末端测序并依据末端序列设计引物，William 等(1991将RFLP 标记转换为SCAR 标记。这些引物直接以基因组DNA 为模板进行PCR 反应扩增多态性区域。如果扩增产物没有长度多态性，对PCR 片段进行限制性酶切，如果其内部序列存在酶切位点的差异，则这样可以将改标记转化为CAPS 标记。RAPD 标记快捷方便，不需预知序列信息，但较低的稳定性限制了其应用。Paran 和Michelmore (1993及

31、Nair 等(1995;1996 通过将与抗虫基因连锁的RAPD 标记转化为SCAR 标记，提高了标记的可靠性及特异性。3.3利用AFLP 标记开发特异性分子标记的策略AFLP 技术是Vos 等(1995发明的一种标记，其原理是将基因组用限制性内切酶消化后，两端连接上接头，用根据接头核苷酸序列和酶切位点特征设计的引物进行两轮PCR 扩增。它具有多态性丰富、检测效率高、重现性强、覆盖整个基因组及无需预知序列信息等优点。然而，由于AFLP 标记操作繁杂且比较昂贵，有必要将其转化为单位点、易操作的标记类型。近年来，关于将AFLP 转化为单位点易操作标记被相继报道(Shanet al., 1999;

32、Meksem et al., 2001; Brugmans et al., 2003 ，本文综合多篇文献及个人实践体会筛选整合一套适宜普通实验室进行AFLP 转化的技术路线。3.3.1对共显性AFLP 标记的转换AFLP 标记多数情况下表现为显性，当不同材料中选择性扩增片段有长度差异时就表现为共显性。133分子植物育种Molecular Plant B比如当检测材料包含双亲及杂种一代时，可在凝胶上分辨出共显性AFLP 标记片段。此时只需回收目标片段并以其为模板用相应的选择性扩增引物再扩增，测序，根据两端序列设计引物，即可将把共显性AFLP

33、 标记转化为特异性的共显性SCAR 标记。3.3.2对显性AFLP 标记的转换由酶切位点及选择性碱基的差异而产生的显性AFLP 标记则需要以下步骤将其转化：(1选择清晰可辨的多态性条带，回收并测序(Nicodand Largiader, 2003 。(2根据AFLP 片段的序列，在符合引物设计基本原则前提下，使扩增片段尽可能大，以提高片段内SNP 出现的可能性。(3显性SCAR 标记的产生。用内部引物对所有样品DNA 进行扩增，如果因为碱基的差异导致引物在某些样品DNA 中不能退火而出现扩增片段有无的差异，此时，显性的AFLP 标记就被转换为特异性的单位点显性SCAR 标记。在对玉米S-CMS

34、 育性恢复基因精细定位过程中利用此法将一个AFLP 标记转化为显性的SCAR 标记SCARE12M7(Zhanget al., 2006 。(4由内部多态性产生CAPS 标记。内部引物的扩增片段如不能转化为显性SCAR 标记，则用一系列较低廉的限制性内切酶去筛选扩增片段的内部碱基差异。为了增加在内切酶识别位点检测到SNP 的机率，只选取4个或5个识别碱基的内切酶。如存在所选酶切位点的差异，在3%EB 琼脂糖胶上检测，则转换为共显性的CAPS 标记(Brugmanset al., 2003 。在对玉米S-CMS 育性恢复基因精细定位过程中利用此法将一AFLP 标记转化为共显性的CAPS 标记CA

35、PSE3P1(Zhanget al., 2006 。(5寻找产生AFLP 标记的原始SNP 。Brugmans 等(2003开发了一套对导致AFLP 产生的多态性进行检测的技术，该技术构思巧妙，检测效率很高。(6将引起AFLP 标记产生的SNP 或INDEL 转化为CAPS 或dCAPS 标记。第一步要获得AFLP 多态性片段的侧翼基因组序列，进而设计引物以扩增包含这些SNP 或INDEL 的片段。侧翼序列的获得有多种方法，首先最便捷的是利用AFLP 序列搜索公共数据库，检出与其高度同源且有足够长的侧翼便于引物设计的序列(Zhanget al., 2006 ；另外Brugmans 等(2003

36、认为Genome Walker Kit (clontech是获得侧翼序列的一种高效手段；而对于基因组中含有大量重复序列的生物来讲，反向PCR (inversePCR 则是更好的选择(Ochmanet al., 1988 。获得侧翼序列并设计引物得到不同材料的扩增产物后，对限制性内切酶识别位点内部的SNP 或INDEL 可直接用相应的内切酶转化为CAPS 标记；对选择性碱基内的SNP 或IN-DEL 标记需转化为dCAPS 标记。DCAPS 标记是在目标突变的基础上利用PCR 引物错配引入一个限制性酶切位点多态性(Neffet al., 1998 。Komori 等(2003对BT 型水稻不育系

37、恢复基因进行了精细定位，其中标记C1361MwoI 即是由一个INDEL 转化而来的dCAPS 标记。3展望分子标记在过去的遗传学研究和育种实践过程中发挥了重要作用。然而，对于近等基因系库的构建、基因/QTL的精细定位、图位克隆及多数非模式植物而言，现有的分子标记数量还远远不够，公共数据库及相关文献中所能提供的遗传连锁图的密度尚需不断提高。在全基因组测序或序列资源相对丰富的作物中采用生物信息学方法开发新标记是经济有效的选择；相反，对于大量可用序列信息较少的非模式生物采用PCR 等生物技术手段开发标记是首选策略。近年来一些学者提出功能标记的概念，功能标记是指从影响特定性状变异基因的功能域开发的分

38、子标记，用于分子标记辅助选择可提高选择效率(Baggeet al., 2007 。应用本文所述各种技术从ESTs 数据库、cDNA 或候选基因中开发标记，如ESTs-SSR 、cDNA-RAPD 、cDNA-SRAP 、cDNA-AFLP ，候选基因中开发SCAR 、CAPS 等，则可望获得连锁于相关性状的功能标记。参考文献Bagge M., Xia X., and Lubberstedt T., 2007, Functional markersin wheat, Curr. Opin. Plant Biol., 10(2:211-216Batley J., Barker G., O'

39、Sullivan H., Edwards K.J., and EdwardsD., 2003, Mining for single nucleotide polymorphisms and insertions/deletionsin maize expressed sequence tag data, Plant Physiol., 132(1:84-91Botstein D., White R.L., Skolnick M., and Davis R.W., 1980,Construction of a genetic linkage map in man using restric-ti

40、on fragment length polymorphisms, Am. J. Hum. Genet., 32(3:314-331Brugmans B., van der Hulst R.G., Visser R.G., Lindhout P., andvan Eck H.J., 2003, A new and versatile method for the suc-cessful conversion of AFLP markers into simple single locus markers, Nucleic Acids Res., 31(10:e55Brumfield R.T.,

41、 Beerli P., Nickerson D.A., and Edwards S.V.,2003, The utility of single nucleotide polymorphisms in infer-ences of population history, Trends Ecol. Evol., 18:249-256Causse M.A., Fulton T.M., Cho Y.G., Ahn S.N., Chunwongse J.,134基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展 The Progress of Development for Plant Molecul

42、ar Markers Based on Bioinformatics and Biotechnology Wu K., Xiao J., Yu Z., Ronald P.C., Harrington S. E., Second G., McCouch S.R., and Tanksley S.D., 1994, Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population, Genetics, 138(4: 1251-1274 Cifarelli R.A., Gallitell

43、i M., and Cellini F., 1995, Random amplified hybridization microsatellites (RAHM: isolation of a new class of microsatellite-containing DNA clones, Nucleic Acids Res., 23: 3802-3803 Fisher P.J., Gardner R.C., and Richardson T.E., 1996, Single locus microsatellites isolated using 5' anchored PCR,

44、 Nucleic Acids Res., 24: 4369-4371 Garg K., Green P., and Nickerson D.A., 1999, Identification of candidate coding region single nucleotide polymorphisms in 165 human genes using assembled expressed sequence tags, Genome Res., 9: 1087-1092 Goff S.A., Ricke D., Lan T.H., Presting G., Wang R., Dunn M.

45、, Glazebrook J., Sessions A., Oeller P., Varma H., Hadley D., Hutchison D., Martin C., Katagiri F., Lange B.M., Moughamer T., Xia Y., Budworth P., Zhong J., Miguel T., Paszkowski U., Zhang S., Colbert M., Sun W.L., Chen L., Cooper B., Park S., Wood T.C., Mao L., Quail P., Wing R., Dean R., Yu Y., Zh

46、arkikh A., Shen R., Sahasrabudhe S., Thomas A., Cannings R., Gutin A., Pruss D., Reid J., Tavtigian S., Mitchell J., Eldredge G., Scholl T., Miller R.M., Bhatnagar S., Adey N., Rubano T., Tusneem N., Robinson R., Feldhaus J., Macalma T., Oliphant A., and Briggs S., 2002, A draft sequence of the rice

47、 genome (Oryza sativa L. ssp. japon ica, Science, 296: 92-100 Hayden M.J., and Sharp P.J., 2001, Sequence-tagged microsatellite profiling (STMP: a rapid technique for developing SSR markers, Nucleic Acids Res., 29: e43 Hu J., and Vick B.A., 2003, Target region amplification polymorphism: a novel mar

48、ker technique for plant genotyping, Plant Mol. Biol. Rep., 21: 289-294 Kantety R.V., La Rota M., Matthews D.E., and Sorrells M.E., 2002, Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat, Plant. Mol. Biol., 48: 501-510 Karagyozov L., Kalch

49、eva I.D., and Chapman V.M., 1993, Construction of random small-insert genomic libraries highly enriched for simple sequence repeats, Nucleic Acids Res., 21: 3911-3912 Komori T., Yamamoto T., Takemori N., Kashihara M., Matsushima H., and Nitta N., 2003, Fine genetic mapping of the nuclear gene, Rf-1,

50、 that restores the BT-type cytoplasmic male sterility in rice (Oryza sativa L. by PCR-based markers, Euphytica, 129(2: 241-247 Konieczny A., and Ausubel F.M., 1993, A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers, Plant J., 4: 403-410 Lander E.S., 1

51、996, The new genomics: global views of biology, Science, 274: 536-539 135 Li G., and Quiros C.F., 2001, Sequence-related amplified polymorphism (SRAP, a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica, Theor. Appl. Genet., 103: 455-461 Liang

52、C., Jaiswal P., Hebbard C., Avraham S., Buckler E.S., Casstevens T., Hurwitz B., McCouch S., Ni J., Pujar A., Ravenscroft D., Ren L., Spooner W., Tecle I., Thomason J., Tung C.W., Wei X., Yap I., Youens-Clark K., Ware D., and Stein L., 2008, Gramene: a growing plant comparative genomics resource, Nu

53、cleic Acids Res., 36(D: 947-953 Lin X., Kaul S., Rounsley S., Shea T.P., Benito M.I., Town C.D., Fujii C.Y., Mason T., Bowman C.L., Barnstead M., Feldblyum T.V., Buell C.R., Ketchum K.A., Lee J., Ronning C. M., Koo H.L., Moffat K.S., Cronin L.A., Shen M., Pai G., van Aken S., Umayam L., Tallon L.J.,

54、 Gill J.E., Adams M. D., Carrera A.J., Creasy T.H., Goodman H.M., Somerville C.R., Copenhaver G.P., Preuss D., Nierman W.C., White O., Eisen J.A., Salzberg S.L., Fraser C.M., and Venter J.C., 1999, Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana, Nature, 402: 761-768 Liu X.,

55、Lu T., Yu S., Li Y., Huang Y., Huang T., Zhang L., Zhu J., Zhao Q., Fan D., Mu J., Shangguan Y., Feng Q., Guan J., Ying K., Zhang Y., Lin Z., Sun Z., Qian Q., Lu Y., and Han B., 2007, A collection of 10,096 indica rice full-length cDNAs reveals highly expressed sequence divergence between O ryza sat

56、iva indica and japonica subspecies, Plant Mol. Biol., 65: 403-415 Lopez C., Piegu B., Cooke R., Delseny M., Tohme J., and Verdier V., 2005, Using cDNA and genomic sequences as tools to develop SNP strategies in cassava (Manihot esculenta Crantz, Theor. Appl. Genet., 110: 425-431 Meinke D.W., Cherr J

57、.M., Dean C., Rounsley S.D., and Koornneef M., 1998, Arabidopsis thaliana: a model plant for genome analysis, Science, 282(5389: 662, 679-682 Meksem K., Ruben E., Hyten D., Triwitayakorn K., and Lightfoot D.A., 2001, Conversion of AFLP bands into high-throughput DNA markers, Mol. Genet. Genomics, 26

58、5: 207-214 Morgante M., and Olivieri A.M., 1993, PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics, Plant J., 3: 175-182 Morgante M., Hanafey M., and Powell W., 2002, Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes, Nat. Genet., 30: 194-200 Nair S., Ben

59、tur J.S., Prasada Rao U., and Mohan M., 1995, DNA markers tightly linked to a gall midge resistance gene (Gm2 are potentially useful for marker-aided selection in rice breeding, Theor. Appl. Genet., 91: 68-73 Nair S., Kumar A., Srivastava M.N., and Mohan M., 1996, PCR-based DNA markers linked to a gall midge resistance gene, Gm4t, has potent