电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS与baX的影响

1、电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS与baX的影响|代写心肌缺血硕士论文|电针内关穴论文        【摘要】 目的  观察电针内关穴对大鼠心肌缺血再灌注损伤的NO、NOS与baX的影响。方法  在鼠冠状动脉左前降支根部穿线置一硅管结扎左前降支，制作心肌缺血再灌注损伤，检测大鼠NO、NOS与baX的水平。结果  模型组心肌总NOS活性显著低于假手术组（P0.05），电针内关组心肌总NOS活性显著高于模型组（P0.01）及电针列缺组和电针合谷组（均为P0.01），电针列缺组和电

2、针合谷组心肌总NOS活性与模型组比较虽有升高，但差异无显著性意义（P0.05），表明电针内关可使心肌局部NOS活性升高。 NO和NOS在心肌缺血再灌注中起着重要的作用1。NO是一种生物活性分子，主要由血管内皮细胞（VEC）合成，通过增加细胞内的环磷酸鸟苷（CGMP）而发挥广泛的生物作用。NO不仅参与了对冠脉血管舒缩的调控，维持有效的冠脉循环血流，而且对缺血后心肌的转归及心肌功能的恢复可能起着重要的作用，当心肌发生MIRI损伤时，明确缺血心肌处NO变化规律及NO对心肌功能的影响有着重要的临床意义。NOS为一含铁的单氧化酶，主要分布于血管内皮细胞、N细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等细胞内，可催化左旋精

3、氨酸转化为瓜氨酸和NO2。心肌组织内的NOS同功酶有两种：原生型（cNOS）和诱生型（iNOS），cNOS主要由血管内皮细胞产生；iNOS主要产生于巨噬细胞中3。baX是bcl-2家庭中的一员，起着促进细胞调节的作用4，采用免疫组织化学方法来分析调节细胞基因的表达已受到人们的高度重视，并被广泛应用于科研及临床研究中。近年来大量实验和临床研究均证实，针刺心包经内关穴对缺血心肌具有明显的保护作用，而降低缺血再灌注损伤程度，有效保护心肌也一直是国内外医学界十分关注的课题。本项研究通过观察电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS及凋亡调控基因baX的影响，试图阐明电针内关抑制心肌缺血再灌注损伤的作

4、用机制。 1  材料与方法 1.1动物与分组 Wistar大鼠50只，体重250-300g，雄性，由湖南中医药大学动物中心提供。将50只动物随机分为5组：假手术组、缺血再灌注模型组、针刺内关治疗组、针刺列缺对照组、针刺合谷对照组，每组10只动物。 1.2实验方法 10%乌拉坦（1ml/100g）腹腔注射麻醉，行插管，接动物人工呼吸机，于第三、四肋间隙处开胸，暴露心脏，冠心动脉左前降支根部穿零号医用缝合线，心电图监测，穿线处置一硅胶管结扎左前降支，以左室前壁发绀并向外膨胀及心电图及S-T段抬高为标志，关闭胸腔，40min后开胸，剪开硅胶管，恢复左前降支灌流，60min后，取静脉血，摘取

5、心脏。 假手术组：冠状动脉左前降支根部穿线后，心电图监测，记录120min内心电图S-T段变化，取静脉血，摘取心脏。缺血再灌注模型组：左冠状动脉前降支根部穿线后，心电图监测，结扎左前降支40min，再灌注60min后，取静脉血，摘取心脏。电针内关治疗组、电针列缺对照组、电针合谷对照组：冠状动脉左前降支根部穿线后，心电图监测，关闭心电图机，电针穴位20min，去电针，心电图监测，结扎左前降支40min，电针穴位20min，再灌注60min后，取静脉血，摘取心脏。 1.3针刺方法 “内关”和“合谷”穴定位参照中国针灸汇萃兽医针灸卷标准穴位图谱；“列缺”穴定位采取拟人比照法，电针用G6805电针仪，

6、疏密波刺激（疏波30Hz，密波100Hz），强度6-15V，进针深度0.5cm左右，针刺“内关”、“合谷”、“列缺”组均将负极接两侧穴位，正极接鼠尾，以前肢出现轻微颤动为度。 1.4观察指标与检测方法 1.4.1心肌一氧化氮（NO）检测  摘取心脏，置于冰冷的生理盐水中冲洗，除去血液，滤纸拭干，分析天平称取0.2g心肌组织，放入小烧杯内，用刻度吸管加入组织块重量9倍的生理盐水，眼科小剪剪碎组织块，倒入玻璃匀浆管中，置于匀浆机上，捣杆垂直插入管中，上下转动研磨40-50次，制备成10%的组织匀浆液，倒入离心管中，350rpm常温离心15min，取10%心肌组织匀浆上清液0.5ml，按一

7、氧化氮试剂盒检测步骤，用754紫外分光光度计测定。 1.4.2 心肌一氧化氮合酶（NOS）活性检测  取组织匀浆上清液100ul，加入底物缓冲液200ul，促进剂10ul，显色剂100ul，37水浴准确反应15min，加入透明剂100ul，终止液2000ul，混匀。754紫外分光光度计，蒸馏水调零，530nm处，1cm光径比色测吸度A值，以双缩脲法测定其组织蛋白含量。 1.4.3 baX蛋白含量测定  采用免疫组化测定，动物再灌注60min后，摘取心脏，取结扎下方左心室肌，大小1cm×0.8cm×0.3cm，10%中性福尔马林固定，经处理制成蜡切片，PB

8、S冲洗，加过氧化酶阻断溶液，室温孵育，PBS冲洗，抗原修复，加第一、第二抗体，镜下观察，苏木素复染，常规分化（脱水、透明、中性树胶封片，试剂盒均由福建迈新生物技术开发公司提供）。 1.5统计方法 各组数据均以“x-±s”表示，采用统计软件SPSSll.10进行数据处理，其差异显著性检验采用方差分析，组间比较若方差齐时选用CSD法；方差不齐时用DunnetT3法。 2  结果 2.1各组NO及NOS的影响结果 模型组心肌NO含量与假手术组相比，有降低趋势，但差异无显著性意义(P0.05),可能与手术外伤的应激性及样本数偏少有关。电针内关组与模型组相比，电针内关组心肌NO含量显

9、著高于模型对照组(P0.05)，且电针内关组与列缺组相比，心肌NO含量也高于列缺组。而电针列缺组和电针合谷组心肌NO含量虽有升高，但与模型组相比差异无显著性意义(P0.05)。以上结果提示，电针内关可使心肌缺血再灌注后心肌局部NO含量升高。 与此同时，由表1可见,模型组心肌总NOS活性显著低于假手术组（P0.05)，电针内关组心肌总NOS活性显著高于模型组（P0.01)，及电针列缺组和电针合谷组（P0.01)。电针列缺组和电针合谷组心肌总NOS活性与模型组比较虽有升高，但差异无显著性意义（P0.05)，表明电针内关可使心肌局部NOS活性升高。 表1 电针内关穴对心肌细胞NO及NOS变化的比较（

10、x-±s) 组别     例数  NO(Umol/gprot)   NOS(u/mgprot) 假手术组  10    311.25±70.4        37.85.28 模型组    10    270.21±72.26 30.983.77 内关组    10   

11、; 379.54±56.02* 42.983.42* 列缺组    10    306.21±61.65 33.077.79 合谷组    10    322.93±75.74 33.798.19 F值                 3.198   

12、0;          5.518 P值                 0.05            0.01 注：与模型组比较*P0.05，* P0.01； 与列缺组比较P0.05，P0.01； 与合谷组比较# P0.05。 2.2各

13、组baX蛋白表达比较 心肌细胞中baX蛋白的表达位于胞质内，呈棕黄色。缺血再灌注模型组阳性率增高，与假手术组比较有显著差异(P0.01)；内关组阳性率明显减少，与模型组比较有非常显著性差异(P0.01)；列缺组、合谷组阳性率与模型组比较无显著性差异(P0.05),见表2。 表2   各组大鼠baX蛋白表达灰光度的比较（x-±s） 组别       例数          baX 假手术组 8 129.72±

14、43.90* 模型组 8 81.64±33.27 内关组 8 115.51±32.45* 列缺组 7 85.05±39.30 合谷组 8 88.05±43.67 注:与假手术组比较P0.01；与模型组比较*P0.01。 3  讨论 内关穴为心包经络穴，又为八脉交会穴，通于阴维脉，难经·二十九难曰：“阴维为病苦心痛。”内关的穴位特性决定了它主治的病征。该穴为人身五大重要穴之一，长期以来一直是治疗心胸疾病的首选穴位。 有实验发现，内源性NO可保护心肌缺血再灌注时心肌损伤，而给予NO的抑制剂则可扩大心肌梗死面积5。NO还是内皮细胞分泌的血管

15、舒张因子的重要组成成分，具有舒张血管、降低血压、抑制平滑肌增殖和血细胞粘附、浸润等重要生理作用。 bcl-2和baX是bcl-2大家族中的两个重要成员，研究证实两者对凋亡细胞起着截然不同的调节作用。Misao等6对急慢性心肌梗死患者心肌组织进行免疫组化检测发现，bcl-2在急性梗死周围的非梗死区表达增加，而对照组和陈旧性梗死心肌细胞无bcl-2表达，但baX则主要在陈旧性梗死附近心肌表达，认为bcl-2的表达和baX的过度表达在缺血再灌注后心肌细胞凋亡的保护和促进中起着重要的病理生理作用。 通过免疫组化染色显示，电针内关穴对由于缺血再灌注损伤引起细胞凋亡的调控基因baX蛋白基因有抑制作用7。电

16、针内关穴对由于缺血再灌注损伤引起细胞凋亡的调控基因bcl-2有促进作用。通过baX在各组大鼠心肌组织中的表达阳性率的比较，充分说明电针内关穴对心肌细胞的保护作用。 参 考 文 献 1Dimerman TL，Lowenstein CJ. Snvder SH Molecular mechanisms of nitric oxidc regulationJ. Cir Res 1993，73:217-222. 2林丽娜，王万铁，李东.一氧化氮合酶在家兔心肌缺血再灌注损伤中的作用J.浙江医学，1999，21(11):655. 3崔世涛，朱洪生.心肌缺血再灌注损伤中一氧化氮合酶及其基因异常表达的研究J.中华医学杂志，1998，18(5):327. 4朱国萍，娄阳，徐冲.bcl-2蛋白家族与细胞凋亡J.细胞生物学杂志,2001,23(1):20-23. 5Williams MW, TaftCS, Ramnauth S, et al. Endogenous nitic oxide(NO) protects against: schaemia-reperfusion injury in the rabbit. Cardiovasc Res，1995，30(1):79-86. 6Misao J, Hayakana Y, Ohno M, et al. Expression of bcl-2 prote