制剂学技术提高植酸酶热稳定性的研究进展

1、 植酸酶称为肌醇六磷酸酶,属于磷酸单酯水解酶,是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(磷酸盐的酶类总称。植酸酶是一种重要的工业酶,是近年来出现的一种新型绿色添加剂,添加到动物饲料中,主要用于猪和家禽,并在一定程度上应用于鱼。植酸酶作为单胃动物饲料添加剂使用时,可以使植物性饲料磷的利用率提高60%,减少饲料中无机磷的添加量,降低饲料成本;能够使动物粪便中无机磷的排出量减少40%,降低磷对环境的污染,保护环境并可改善可用性矿物质、微量元素、氨基酸和能源;还可以解除植酸对金属离子和蛋白质的螯合作用,提高机体对蛋白质和多种微量元素的利用率,促进动物生长发育,提高生产性能。植酸酶的抗逆性,尤其是热稳定性不能

2、满足饲料及饲料加工的要求,成为制约植酸酶推广应用的重要限制性因素之一。鉴于植酸酶对提高畜牧业生产效益和降低磷对环境的污染有重要意义,提高植酸酶的耐热性成为科研领域研究的新热点。1影响植酸酶产品热稳定性的因素1.1植酸酶菌株从烟曲霉和黑曲霉中分离的植酸酶添加到饲料中,在制粒温度为75时,这2种植酸酶在颗粒饲料中的活性回收率是相似的;但在制粒温度为85时,来自黑曲霉的植酸酶活性比来自烟曲霉的植酸酶活性要丧失得更多。1.2制粒过程制粒过程中的高温、高湿和挤压是造成植酸酶活性损失的关键因素:1高温引起酶蛋白分子中氢键和疏水键断裂,从而改变酶分子的构象,使酶失活。生物酶制剂热稳定性差,易失活,在常温条件

3、下长期存放的干燥酶粉也易失活。颗粒温度达到84或87时,则酶的活性丧失17%或54%;2R P Igamnazarov等(1999指出,植酸酶去折叠温度与水分活度相关。完全干燥的植酸酶去折叠温度为165;含12%的水分时去折叠温度迅速降为95;含16%的水分时去折叠温度降为8890。在制粒时,湿与热同时起作用。相比干热,湿热更具穿透性,更能够穿透到植酸酶内部,破坏酶的三维结构;3高压能改变酶蛋白的空间多维结构而导致酶变性。制剂学技术提高植酸酶热稳定性的研究进展张萍1,2王成润1邹积宏2金一11.浙江大学药学院2.黑龙江大学生命科学学院摘要植酸酶作为一种生物型饲料添加剂对提高饲料中磷的利用率、动

4、物的生产性能及减轻动物高磷排泄物对环境的污染具有重要意义,因此,植酸酶的研究有重要的科学和实用价值。但由于其热稳定性差,推广和应用受到了限制。关键词植酸酶热稳定性制剂学中图分类号:S816.7文献标志码:A文章编号:1002-2813(201001-0019-04收稿日期:2009-09-25通信作者:金一 1.3动物消化道pH酶的活性具有确定的最适pH,pH的变化可引起酶中基团的解离,导致酶结构变化,从而影响酶的活性。动物消化道内有一条适合生化反应进行的pH谱线。Lindberg(2007报道,猪日粮中添加植酸酶后,在胃中可检测到总酶活超过50%,极显著高于小肠前段和后段。1.4植酸酶产品的

5、剂型植酸酶产品包括,液体酶、粉酶、普通颗粒酶和包被型颗粒酶。液体酶的热稳定性差,但它是在制粒后喷涂在颗粒表面,因此避免制粒中湿热破坏。粉酶完全暴露在湿热环境中,热稳定性较差。普通颗粒酶隔离分子与外界接触,一定程度上提高植酸酶的热稳定性。包被颗粒酶是将成型后的颗粒植酸酶采用包衣剂,在表面形成一层坚固而易溶的薄膜,使植酸酶颗粒与外界隔离,同时避免饲料中矿物元素等对酶活的破坏,耐高温水平也有一定提高,热稳定性最强,使用范围更广。Eeckhout等(2000研究发现,在82条件下,猪饲料中颗粒植酸酶的活性保留值为60%。而NOVO和BASF公司生产的包被颗粒植酸酶在85下处理30s,酶活性保留率约达到

6、70%;而对照组是未经包被的酶粉,其酶活保留率仅为20%。2制剂学技术提高植酸酶热稳定的方法提高植酸酶热稳定性常用的方法有以下几种: 1自然选择法:即筛选耐高温菌种释放的植酸酶;2固定化包埋:将酶固定在不溶性载体上,从而稳定酶构象,消除逆性因子的变形作用,从而提高植酸酶稳定性;3蛋白质工程法:即通过基因工程重组得到耐高温酶的基因,再表达获得热稳定性植酸酶;4化学修饰法:通过化学试剂特异性修饰酶活性中心的某个或某类氨基酸,从而稳定蛋白质的构象,提高其耐热性;5制剂学方法:通过向植酸酶溶液添加稳定剂、将植酸酶与载体结合制成普通颗粒、将植酸酶颗粒进行液体后喷涂和包被等制剂学技术来提高植酸酶的热稳定性

7、。2.1添加稳定剂1盐。盐的添加能显著改善酶的热稳定性,因为盐类主要存在离子键作用,当酶的活性中心含有离子作为配位体时,降低分子内静电排斥作用,增加酶的稳定性。另外,盐可作为水分子的替代物占据水的位置,排除自由水对酶造成的不稳定影响。盐的种类和质量浓度也会影响到植酸酶的热稳定性。据报道,阳离子的稳定化作用是(CH34N+>NH4+>K+、Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+,阴离子是SO42->Cl->Br->NO3-,因此,一般采用的无机盐有MgSO4、(NH42SO4、CaSO4、CaCl2、MgCl2和NaCl等。Ha等(2000研究一种新

8、的热稳定性的植酸酶部分或充分结合Ca2+时的晶体结构,结果发现,Ca2+对于该酶的活力和热稳定性有重要作用。Yang Mun Choi等(2001从Bacillus sp KHU-10中制取的植酸酶液中加入一定量的Ca2+,在60下保温10min后其相对酶活为98%,而未加Ca2+的原酶液在同样温度下保温相同时间后相对酶活几乎为零。苏东海等(2004研究不同种类及不同质量浓度的盐在干热和湿热条件下对植酸酶活性的影响,在干热情况下,相对包被质量浓度为5%的Na2SO4或10%的NaCl抗干热效果较好;在湿热情况下,15% NaCl或5%Na2SO4的保护作用达到最大值,MgSO4和(NH42SO

9、4作用不明显。专利EP0758018A1描述在用盐来稳定固态植酸酶时,发现二价阳离子效果最好而且无机盐与酶的质量比控制在5%90%效果较好。2多羟基化合物。多羟基醇和糖类等多羟基化合物能形成氢键,通过氢键与酶蛋白表面分子相连接,使酶蛋白分子稳定化;有助于形成可增加表面张力和溶液黏度的溶剂层,降低蛋白水解而起到稳定酶的作用。多羟基化合物还能够通过填补酶空间结构的空隙,降低由于加热引起酶空间结构改变而导致的酶活损失。专利WO93/16175描述用尿素、甘油或山梨醇等来稳定液态植酸酶。陈惠等(2004研究发现,分别加入甘露醇、葡萄糖和海藻糖均能提高植酸酶在高温下的热稳定性,与不加糖的对照组比,酶活力

10、平均保留率约提高10%,其中以0.4mol/L海藻糖提高植酸酶热稳定的效果最好。苏东海等(2004研究不同种类及不同质量浓度的糖在干热和湿热条件下对植酸酶活性的影响,在干热情况下,添加40mg/g海藻糖的抗干热效果最好,蔗糖其次,葡萄糖较差;在湿热情况下,3种糖在60mg/g酶质量浓度内对保留剩余酶活都有一定的作用。3其他稳定剂。Chang Chih Chen等(2001研究发现,在植酸酶溶液中加入可溶性淀粉和高粱糖浆废弃液可提高植酸酶的热稳定性。在80下加热 10min,仍有67%的酶活。其原因可能是:高粱糖浆废弃液和淀粉阻止传热,对酶起到一定的保护作用,但其保护机制还需进一步研究。专利WO

11、2005/074707以酪蛋白为稳定剂,与含有ZnSO4的植酸酶浓缩发酵液及玉米淀粉混合制软材,应用挤出滚圆的方法制得植酸酶颗粒。与对照组相比,78制粒条件下酶活保留率提高10%。2.2制备普通颗粒制备普通植酸酶颗粒时首先要筛选合适的载体。合适的载体要具有如下特征:1载体形成的颗粒要有一定的机械硬度;2载体不能使酶活性降低;3载体在水中能迅速崩解释放出植酸酶;4载体不能与饲料中的成分发生反应,以保证植酸酶的活性和稳定性。动物饲料添加剂中常用载体有玉米淀粉、玉米芯粉、云石粉和乳糖等。普通颗粒酶相当于将植酸酶分子封闭在若干个小区内,隔离分子与外界的接触,一定程度上提高植酸酶的热稳定性。2.3液体后

12、喷涂技术近年来,有些饲料颗粒制造厂采取外喷的方法添加植酸酶。制粒冷却后在其饲料颗粒表面上喷涂液态植酸酶,但这需要额外增加某些加工设备及加工工序,而且外喷方法不易添加均匀,并且在运输过程很容易将颗粒外表喷涂的植酸酶磨擦掉,失去添加意义。这使得液体后喷涂技术在生产稳定性植酸酶中的应用受到限制。2.4制备包被型颗粒采用包被技术将植酸酶内添加,能有效的降低植酸酶在制粒等高温高湿处理过程中活性的损失,又能均匀的混合在动物颗粒饲料中,易于动物采食,大大提高植酸酶的利用效率。包被工艺与制药领域中制备包衣颗粒剂的工艺基本一致。包衣材料的筛选和包被工艺的选择,不仅影响着包被植酸酶的抗逆性,即耐高温和高湿,还要求

13、包被颗粒在动物消化道内迅速释放被胃肠道利用,且在包衣后外表面形成较为坚固的膜,能够起到阻热、防潮和隔绝空气的作用。从实际生产方面考虑,还要求包衣材料价格较低廉,加工成本低。1国外制备包被型颗粒研究状况。国外研究植酸酶热稳定性的时间较早,包被型植酸酶颗粒技术较为成熟。西欧和北美的有些科研机构在提高饲用酶制剂的热稳定性方面取得较大的进展。欧洲著名的酶制剂生产商NOVO和BASF公司自20世纪90年代开始对饲用酶在饲料高温制粒条件下的热稳定性进行研究,取得重大进展。他们采用的包被型饲用植酸酶生产工艺为,在植酸酶浓缩液中加入纤维素、碳酸钙和糊精,经混合、挤压、切割、圆整、低温干燥和筛分,制成含酶小颗粒

14、。然后再涂抹由氢化牛油、碳酸钙和高岭土组成的混合物,低温干燥,制成包被型含酶颗粒。该包被型颗粒酶经制粒温度85处理30s,酶活性保留率约达到70%;而对照组未经包被的酶粉酶活保留率仅为20%,植酸酶的热稳定性得到了大幅度的提高。专利WO2007/044968筛选了33个处方,其中在8595制粒温度下处理30s后酶活保留率超过90%的处方,是以硫酸钠晶体为核心,应用流化床顶喷制粒法向核心喷涂植酸酶发酵液、玉米淀粉和聚乙烯醇(PVA,制成含酶颗粒。再在喷雾干燥包衣机中向含酶颗粒连续地喷涂保护层PVA和滑石粉,然后经过干燥慢慢冷却的过程制成包被型含酶颗粒。2国内制备包被型颗粒研究状况。由于植酸酶在畜

15、牧行业和环境保护中的重要意义,近年来我国学者和科研机构也做了大量工作,并取得一定成效。苏东海等(2004观察不同种类及不同质量浓度的糖和盐在干热及湿热的情况下对植酸酶残存酶活的影响,通过正交试验得到包埋颗粒,当蔗糖的添加量为40mg/g时,氯化钠包覆用量为淀粉质量的10%,明胶作外包被,用量为淀粉质量的1.5%,得到包埋颗粒,其包埋率为82.8%。包埋后水分活度大于0.35时,包被酶在干热的情况下残存酶活比原酶有较大的提高,残存酶活提高8.7%,湿热的情况下,残存酶活提高58.3%。专利CN1981597A描述一种饲用耐高温植酸酶的制备方法。先将植酸酶与辅料滑石粉和碳酸钙混合,用黏合剂黄原胶溶

16、液制软材,经挤压滚圆后干燥制成含酶微丸;再置于包衣锅中使用羟丙基甲基纤维素和聚乙二醇水分散体进行包衣,制成包被型含酶颗粒,最后将包衣后的微丸置于3050干燥箱内干燥38h。此法制得的包被型含酶颗粒可在85处理1min后酶活保留率超过85%。处方为植酸酶800g、羟丙基甲基纤维素10g、黄原胶 10g 、聚乙二醇30g 、滑石粉50g 和碳酸钙50g 。专利CN1775067A 制备一种肠溶包膜颗粒植酸酶。工艺为将植酸酶粉、稳定剂与黏合剂羟甲基纤维素混合,经切割、整圆、50低温干燥、喷雾成膜和再干燥制得包膜植酸酶颗粒。其中植酸酶粉、稳定剂和肠溶膜材料的比例为85.8%90.4%、6.8%12.2

17、%和0.7%16%。稳定剂的组分构成为蔗糖75%、食盐10%和蛋白质15%。成膜材料由丙烯酸树脂、虫胶和羟乙基纤维素组成,是肠溶型脂溶性包衣材料,以乙醇溶解,质量比为111。该包膜植酸酶颗粒在80温度下保温5min 后,酶活保留率超过85%。专利CN 101168734A 在植酸酶的发酵液中加入玉米淀粉、玉米芯粉、云石粉和乳糖(比例为30%50%、10%30%、5%15%和10%25%,经摇摆制粒、抛圆和干燥制成含酶颗粒。再使用羟丙基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、聚丙烯酸树脂和聚乙烯吡咯烷酮进行流化床包衣和干燥筛分,得到胃溶性包被植酸酶颗粒。所用包衣材料为胃溶性水溶性材料,以水溶解,不使用有机溶

18、剂。各包衣材料按10%30%10%30%30%50%10%30%比例形成。所得包被型植酸颗粒在制粒温度达85时,仍能达到90%的酶活保留率。与普通植酸酶相比,在85条件下,制得的含酶颗粒与包被型植酸酶的酶活保留率分别提高24%和35%。3研究展望植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂,应用范围广泛,需求量大,而且它对提高畜禽的生产性能和健康水平、减少环境污染和保护生态环境有重要意义。植酸酶的研究在国际上已开展了几十年,而对其热稳定性的研究起步较晚,还有待进一步深入。 在提高植酸酶热稳定性的方法中,与其他方法相比较,制剂学方法提高植酸酶热稳定性,包括在酶液中添加稳定剂、选择适合的载体制成普通颗粒、后喷涂酶液体及进行酶的包被处理等,一般不会改变植酸酶的理化性质,并且具有开发期短、成本低和耐热效果显著等优势。笔者认为:植酸酶热稳定性研究需要与植酸酶活性的检测,储存稳定性,尤其是动物体内应用效果的评定研究相结合。此外,单纯提高植酸酶的耐热性是远远不够的,同时具有耐热性高、最适pH 和蛋白酶抗性低等综合性能的植酸酶才是今后发展的关键所在。参考文献1王琤韦华,翟明仁.植酸酶的研究进展及应用.养殖与饲料,2005(6:13-16.2廖明星,顾振新.植酸酶基因工程及开发利用研究.食品科学,2003,24