胰蛋白酶抑制剂的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定及其保鲜作用的研

1、上述三种抽样设计，都是要求从总体构架中直接抽取个别的样本单位组成样本，进行调查。而整群抽样则是先把总体按其自然形态（一般是地域范围）分为若干群，然后随机抽选一两个或若干个群作为样本，并对已抽中的群所包括的单位进行全面调查。整群抽样与分层抽样既相同又有明显区别。整群抽样是按群体来分层，可看作是分层抽样的特殊形式。但它们之间有两点主要区别：（1）分组要求不同。即分层抽样中要求各层间差异较大而层内差异较少；整群抽样要求群内差异大而群间差异较小。（2）样本单位的分布不同。即分层抽样中样本单位较均匀地分布于各层内；而整群抽样中的样本单位集 中于抽中的 几个 群体内。整群抽样优点：（1）它适用于没有或难以

2、构造总体框架的总体的抽样调查。(2）调查单位比较集中，工作方便，可以减少调查人员旅途往返时间和费用。但另一方面，也正由于调查单位集中，显著地影响了单位分布的均匀性，导致在样本容量一样情况下，整群抽样的抽样误差大于其它方法的抽样误差。整群抽样中的“群”的概念范围，应根据市场调研的目的任务具体确定，可大可小，例如在我国可以有几个经济区域的划分；可以按省、市、自治区、县、乡（镇）等行政区域划分；大城市内可按区、地段、街道、居委会等划分；还可以按企业、机关、学校、村庄等社会组织划分等。在市场营销调研中可以把家庭作为最小的“群”。1单阶段整群抽样（One-Stage Cluster Sampling）单

3、阶段整群抽样，就是将总体分成若干群后，随机抽取一两个或若干个群作为样本，然后直接对这部分群内每个单位进行普查，用普查数据推断总体的情况。例如，假定调研人员想调查一下天津市居民对洗涤剂类产品的消费情况，为企业进行市场细分提供决策依据。若采取单阶段整群抽样，其具体做法是：（1）列出天津市的全部街区Nb；（2）从Nb个街区中按简单随机抽样法抽取n个街区，作为样本；（3）对n个街区内的全部家庭户用直接访问法、电话访问法或邮递访问法，调查其购买使用的洗涤剂类产品的基本情况，并估计出天津市洗涤剂类产品市场的情况。在抽样过程中，只要抽到了“群”，也就等于抽到了样本单位(调查单位，所以称其为单阶段整群抽样。2

4、两阶段整群抽样（Two-Stage Cluster Sampling）先将调查总体各单位按一定标准（一般是区域）分成若干群体作为抽样的一段群体；然后将各一段群体又分成若干小的群体，作为第二段群体；再按照随机原则，先抽选出若干一段群体即为一段样本群，然后再在一段样本群体中抽选出第二段样本群；最后，对第二段样本群体进行全面调查以推断总体的情况。就上例来说，也就是可以设计为：先在天津市总体范围内选取若干街区，再在选中的街区内选取若干居委会。假定天津市有200个街区，每个街区有20个居委会；我们拟从这4000个居委会的总体中选取100个居委会样本群；于是总的抽样比是100/4000=1/40，也就是说

5、平均说对居委会的总的抽样比是40个抽1个。在各种情况下，街区抽样比（一般抽样 比）和居委会再抽样比(二段抽样比）的积必定等于1/40。因此，如 果调研 人员想 要 以 1：P1P2的比例抽取第二阶段样本群，可以通过1：P1的比例，选取一段样本群和以1：P2的比例（从所选的一段样本群中）选取第二段样本群来完成。即选取概率为。本例中，假如以1:2比例选取一个街区样本群，然后可以按1:20比例从所选街区中选取居委会样本群。因为第一段抽取100个街区（），第二段在100个街区中又各抽取了一个居委会（），这样的抽样结果是抽出100个居委会。就这个例子来说，还可设计出其它五种两阶段抽取100个居委会群体的

6、方法，如表8-9所示。调研人员应当选择哪一种方法，要视具体情况而定。从收集资料的费用来看，第二阶段抽样比值应当取高值。第二阶段抽样比值取高值，就会有许多家庭从所选的每一街区中抽取出来；这样使实地调查集中在少数的街区内进行，因而节省了调查费用。据此原则最好选择表中的“抽样方法6”。从统计效果来看，则需要较小的第二段抽样比值。因为这样可以使样本单位分布范围更大些更均匀些，这样的样本代表性是最好的，据此样本推断总体参数，效果也是最好的。按照这个原则就宁可选择“抽样方法1”。在实际的抽样过程中，往往要同时考虑费用和统计效果两个因素，因此在列举的两阶段抽样比之间需要找到一个最佳的折衷点。3多阶段整群抽样

7、（Multistage Cluster Sampling）上述讨论过的抽样设计，一直限于在单独一个城市或较小的区域范围内。市场营销所涉及的范围往往要比这个范围大得多，例如在全国范围内抽样调查各家庭消费洗涤剂类产品的情况。这时两阶段抽样设计就不能需足需要。而要进行多阶段整群抽样设计。这种全国性的抽样，我们可以从30个省级群体抽取部分一段群体，从部分省级群(一段群体中分表8-9：两阶段整群抽样举例抽样方法编号第一阶段抽样比（1/P第二阶段抽样比(1/P2）总抽样比(1/P1P2第一阶段选取区街数第二阶段从各选中的街区中选取居委会数11/21/201/40100121/41/101/4050231/

8、81/51/4025441/101/41/4020551/201/21/40101061/401/11/40520别抽取部分区、县级群体作为二段群体；从抽中的区、县级群体(二段群体中抽取部分乡镇或街区作为三段群体；从三段群体中抽取部分村庄或居委会作为四段群体；最后从四段群体中抽取要求的家庭户组成最后的样本。这就是一种从大群中抽小群的典型的多阶段整群抽样。由于抽样阶段过多也会带来工作的繁索，因此一般以设计为三个阶段，至多四个阶段为宜。而且多阶段的各个阶段群体抽取方式，可以用简单随机抽样或系统抽样；各阶段可用同一种抽样方式，也可用不同抽样方式，视具体情况而定。但由于整群抽样要求群间差异要尽量小，因

9、而不宜采用分层抽样方式抽取样本群。多阶段整群抽样的优点：（1）由于多阶段抽样过程，前几个阶段都是过渡性的，直到最后一个阶段才能抽取实地 调 查单位，因此，多阶段抽样设计，为最后抽取调查单位提供了极大的便利。（2）在调查总体范围大、单位非常多、情况复杂的抽样调查中，采用多阶段抽样，可以节约大量人力，旅途往返费用和时间。（3）可以使抽样方式更加灵活和多样化。这种多阶段抽样设计实际上可看作是各种抽样方式结合应用的抽样设计。多阶段整群抽样设计的基本原则，同样是各阶段抽样比的积等于总的抽选概率，用公式表示为。 现将上述 两 阶 段抽样所用例子改为： 自200 个街区中 抽取 部 分街区；从选中的 街 区

10、中抽取居委会；再从选中的居委会中选取居民户的三阶段整群 抽 样。 假设各街区中每个街区有20个居委会，共400,000个家庭；最后要抽取2,000个家庭作为样本进行调查。于是总的抽样比(概率）为。按此抽样比我们可有下述三阶段抽样的多种设计方法（见表8-10）。表8-10：2000户家庭的三阶段整群抽样设计方法编号一阶段抽样比（）二阶段抽样比（）三阶段抽样比（）总抽样比(）一阶段 选 取区街数二阶段选取居委会数三阶段选取的家庭数12345:1/21/41/51/81/5:1/101/51/41/51/10:1/101/101/101/51/4:1/2001/2001/2001/2001/200:

11、10050402540:24542:1010102025:4概率与样本容量成比例的抽样（PPS）前几种抽样设计中，我们没有考虑各阶段的同级群体的大小因素，或者说它是以假定各群体大小相同为前提的。在实际调查过程中，这种情况是极少见的，更多的情况是划分的各群体大小不一样。那么，我们一旦遇到抽样群体大小极不相同时，最好利用抽选概率与样本容量成比例的抽样方法，简称PPS法。这种方法实际上是对前述几种方法的修正，使得原先大小不同的群体被抽中的概率相同变得不同，以保证样本容量大的群体被抽中的可能性大于样本容 量 小 的群体。其具体的操作过程如下：（1）决定在最后阶段抽取的样本总容量和调查群的平均规模。我们

12、假设要从1000户家庭的总体中选一个总容量为60的样本，每户家庭被选取的可能性（总概率）为60/1000即0.06；从所有居委会中抽选3个居委会，平均自每个居委会抽取20户家庭。（2）列出（或估计）各群体实际包括的最终样本单位数。我们这里只设计两阶段抽样，那么就是列出第一阶段的每个居委会的家庭数（前几种设计是不考虑这个因素的），并将每个居委会按地理位置或容量大小排列，就成了分层抽样构架，这会大大提高样本的代表性。（3）计算出抽样构架的累计容量。本例就是家庭累计数，并分给每个家庭1个1至1000中的号码（见表8-11）。表8-11摘 要【目的】本实验通过改变电泳时的相关条件，挑选出一种能各居委会

13、家庭数- 聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法鉴定红豆中提取的胰蛋白酶抑制剂家庭数累计15%、明胶浓度为累加号码-PAGE电泳，点样量为抽中单位（蛋白含量为0.5412 345、36h300225 125200关键词3005256508501000 挥发性盐基氮 301-525526-650651-8501.1 实验的研究意义071324953）泛指具有抑制蛋白酶活性作用的一类物质，在动物、植物、微生物中广泛存在，能与体内参与各种调控作用的丝氨酸蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命活动过程1合 计,也为以后进一步研究蛋白酶抑制剂在保鲜方面的应用提供实验依据。同时，在对天然胰蛋白酶抑制剂的分

14、离、提纯及其天然结构和生理功能的研究中，知道它们具体含有多少种胰蛋白酶抑制剂对其安全性和应用性的研究是很重要的。有研究表明胰蛋白酶抑制剂共有13种家族，但在过去的对胰蛋白酶抑制红豆剂明胶-聚丙烯凝胶电泳实验中，最多只能电泳出5条条带。因此，我们通过不断改进明胶-PAGE，挑选出了一种灵敏度高、能分离出清晰条带、背景透明的最佳电泳方法，使胰蛋白酶抑制剂的分离、纯化鉴定方法有了一个新的台阶，为更深入研究胰蛋白酶抑制剂提供一个实验平台。3在以往的红豆明胶（4）用简单随机抽样法抽取10min，15min个号分别为324、071和953，于是样本居委会序号是2、1和5（见表9-11最后一栏。这种抽样就使

15、得容量不等的居委会有与其 成比 例 的不 同的 中选 概 率，本例中分别为 。分离出更多种胰蛋白酶抑制剂的明胶-PAGE方法。（2）找出胰蛋白酶抑制剂与食物保鲜的关系。3 实验原理 3.1 胰蛋白酶抑制剂的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳带有电荷的粒子在电场中移动的现象称为电泳。不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下移动速度不同。根据蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶的作用特点，采用明胶-PAGE，在分离胶中加入明胶作为靶蛋白酶的底物，电泳后胶板（含明胶底物）用靶蛋白酶进行酶解时，除了蛋白酶抑制剂存在处的明胶不被酶解外，胶板中其他位置的明胶均被靶蛋白酶水解。酶解后再用水冲洗干净凝胶板；最后，经考马斯亮蓝

16、R250染色，显色带即为靶蛋白酶抑制剂的作用效果（抑制剂抑制蛋白酶活性从而使明胶不被水解）。采用不同靶蛋白酶可以检测同一植物中不同的蛋白酶抑制剂。3.2 挥发性盐基氮（T.V.B-N）的测定挥发性盐基氮（T.V.B-N）是一种有毒物质，指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质。这些分解产物的含量与动物性食品的新鲜程度有明显的对应关系。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸出后，可用酸性溶液吸收后，再用标准盐酸溶液滴定，计算其含量。本方法先将挥发性盐基氮（T.V.B-N）溶解在溶液中。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量

17、乘以换算系数，即为挥发性盐基氮含量。(1 挥发性盐基氮中的氮在弱碱剂作用下变成氢氧化铵, 后者在通气加热时分解产生氨气反应式为: 2NH4+ + Mg(OH2 2NH4OH + Mg2+NH4OH NH3+ H2O(2生成的氨气随水蒸气蒸馏出来后, 遇到弱酸硼酸则生成硼酸铵。2NH3 + 4H3BO3 (NH42B4O7 + 5H2O(3用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出(NH42B4O7氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得游离氮的含量反应式为： (NH42B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO3T.V.B-N (mg/100g=V1-样品定

18、容的总体积，单位：mLV2-样品液滴定时消耗0.01N盐酸溶液的体积,单位：mLV3-空白消耗0.01N盐酸溶液的体积,单位：mLV4-测定时取样品液的体积,单位：mLN-盐酸溶液的当量浓度,单位：mol/LW-样品重量,单位：g14-1毫升1N盐酸标准液相当于氮的毫克数3.3 猪肉感官检验方法 目前我国对猪肉的感官检验采用的是GB27071994猪肉感官指标，本实验的样品经放置不同时间后，表现出不同的感官特性，因此为了方便与国标对比和观察记录，我们设定了4个分值区，每个分值代表不同的感官特性和新鲜度(见表5。10分即为国标中所规定的新鲜猪肉感官特性，参照GB27071994猪肉感官指标来确定

19、各样品是否符合新鲜肉的标准6。通过气味、色泽、粘度、弹性进行评分（标准见表1）。根据评分小组对其灵敏程度，确定每项权重分别为0.4、0.3 、0.1、0.2，计算加权平均分。其中满分为10分，最好为10-9分；较好为8-6分；较差为5-2分最差为1-0分；6分以上为鲜度良好。最后，计算出加权平均值为综合感官评定结果。评分小组由我们3人组成。表1 猪肉感官特性评分标准等级项目最好（109）较好（86）一般（52）最差（10）气味具有鲜猪肉固有的香气无异味有一股臭味有刺鼻的恶臭色泽肌肉有光泽，红色均匀，脂肪乳白色肌肉光泽度稍微下降，呈鲜红色，脂肪微微变暗肌肉呈暗红，脂肪与肌肉相连的部分微微发绿肌肉

20、呈暗红，表面发绿弹性有坚韧性，指压后的凹陷立即恢复有坚韧性，指压后的凹陷可恢复指压后的凹陷恢复较慢指压后的凹陷恢复很慢粘度不粘手，表面湿润只是表面微微发粘表面粘手表面有大量粘液，很粘手3.4感官检验方法通过气味、色泽、粘度、弹性进行评分（标准见表2）。根据评分小组对其灵敏程度，确定每项权重分别为0.4、0.3 、0.1、0.2，计算加权平均分7。其中满分为10分，最好为10-9分；较好为8-6分；较差为5-2分最差为1-0分；6分以上为鲜度良好。最后，计算出加权平均值为综合感官评定结果7,8。评分小组由我们3人组成。4 实验设备表3 实验仪器设备名 称规 格数 目备 注冰箱-1台4电热恒温水浴

21、锅-1台电子天平-1台电子分析天平-1台微量注射器50L1支移液枪5mL、1mL、0.1mL各一支配套枪头稳压稳流电泳仪-一台电吹风各品牌皆可1台量筒50mL、500 mL、1L各一个烧杯50mL、100mL、500mL50mL：35个；100mL：10个；500mL：4个培养皿-6个夹心式垂直板电泳仪各品牌皆可1台玻璃板、薄胶条、夹子、梳子、导线吸管各品牌皆可4支试剂瓶1000mL、500mL、250mL、50mL和棕色瓶1000mL:2个；500mL：5个；250mL：10个；棕色瓶：4个剪刀-2把中等大小可调高速电动匀浆机-1台玻璃棒-4支试管直径：25mm；长：210mm20个配套试管

22、架：2个胶塞4号、6号各3个锥形瓶100mL15个直行冷凝管-1支含有其他配套接管玻璃管L形的、直形的L形4支直形2支乳胶管-1米圆底烧瓶1L1个接液管-1个铁架台-2个含有夹子等电炉-2台含有石棉网酸式滴定管-1支50mL标签纸-滤纸中速1盒小漏斗-17个广泛pH试纸-一包保鲜膜-1卷5 实验材料及试剂5.1 实验材料5.1.1红豆5.1.2红豆提取的胰蛋白酶抑制剂采用硫酸铵饱和盐析、Sephadex G-75分子筛层析柱及DEAE-Cellulose-52离子交换层析柱对赤豆（Azuki Bean）胰蛋白酶抑制剂进行提取及分离纯化（已有）。5.1.3鲜肉新鲜猪肉5.2 实验试剂5.2.1

23、试剂准备表4 实验试剂试剂名称规格丙烯酰胺（Acr）分析纯甲叉双丙烯酰胺(Bis分析纯浓盐酸分析纯氯化钠分析纯过硫酸铵(AP生化试剂四甲基乙二胺(TEMED生化试剂甘氨酸生化试剂甘油/蔗糖分析纯甘氨酸分析纯三羟甲基氨基甲烷(Tris生化试剂冰乙酸-考马斯亮蓝R250分析纯甲醇-无水氯化钙-明胶生化试剂凡士林-溴酚蓝分析纯胰蛋白酶分析纯硼酸分析纯甲基红分析纯溴甲酚氯 或 次甲基蓝分析纯氧化镁-碳酸钠分析纯无水乙醇分析纯沸石-氢氧化钠分析纯5.2.2 电泳部分的凝胶配制方法（1） 30%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（Acr）、0.80g甲叉双丙烯酰胺（Bis）。先用50mL蒸馏水溶解，如溶解不了，可

24、加热30oC-50OC溶解，再用量筒定容至100mL，让后过滤，后置于棕色瓶。4oC下保存备用。（2） 10%过硫酸铵（AP）溶液：取1g过硫酸铵溶解后，定容至10mL，现配先用。（3）1mol/L HCl 100mL：在通风橱去HCl 8.4mL，加蒸馏水至100mL。（4）分离胶缓冲溶液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8）：取18.15gTris(三羟甲基氨基甲烷溶解后，加1mol/L HCl溶液约48mL，调pH至8.8定容至100mL。（5）浓缩胶缓冲溶液（0.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8）：取3.00gTris(三羟甲基氨基甲烷溶解后，加加1m

25、ol/L HCl溶液约20mL，调pH至6.8定容至50mL。（6）电极缓冲溶液（0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3）：取3.00gTris(三羟甲基氨基甲烷、14.40g甘氨酸，加水溶解后，测定pH8.3，定容至500mL，用时稀释3倍。（7）5%明胶：称取1.00g明胶，加入20mL蒸馏水，溶解混匀后低温保存。（如果难以溶解可于37oC水浴中搅拌溶解）。（8）0.5%溴酚蓝指示剂：去0.25g溴酚蓝，加蒸馏水溶解，定容至50mL。（9）10%四甲基乙二胺(TEMED：取2.00g四甲基乙二胺(TEMED，加蒸馏水溶解，定容至20mL。5.2.3 酶解和

26、脱酶部分的试剂制备方法（1）0.5mol/L HCl：取2.1mL浓盐酸，加蒸馏水定容至50mL。（2）0.05mol/L Tris-HCl，Ph7.5（内含0.2mol/L NaCl，0.01mol/L CaCl2）：取3.03gTris、40.3mL 0.5mol/L HCl溶液，加入6.25gNaCl和0.50g CaCl2，加蒸馏水至500mL，用试纸检测pH7.5。（3）100U/mL的胰蛋白酶液0.2mg/mL：称取40mg胰蛋白酶，用0.05mol/L Tris-HCl，Ph7.5（内含0.2mol/L NaCl，0.01mol/L CaCl2）定容至200mL。5.2.4染色和

27、脱色部分的试剂制备方法（1）考马斯亮蓝R250染色液（0.1%考马斯亮蓝R250-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：取0.5g考马斯亮蓝R250，加入225mL甲醇、50mL冰乙酸，用蒸馏水定容至500mL，过滤后使用。（2）0.5mol/L NaCl脱色液：取29.25g NaCl，用蒸馏水定容至1000mL。5.2.4 测定挥发性盐基氮含量的试剂配制方法（1）吸收液（2%硼酸溶液）：称取5.00g硼酸，用蒸馏水定容至250mL。（现配现用）（2）0.1%甲基红乙醇溶液：称取0.0500g甲基红，用无水乙醇定容至50mL。（3）0.1%溴甲酚绿乙醇溶液 或 0.1%次甲基蓝乙醇溶液：称取0.0

28、500g甲基酚绿，用无水乙醇定容至50mL 或 称取0.0500g次甲基蓝，用无水乙醇定容至50mL。（4）混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合；或用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。（现配现用）（5）0.25mol/L氧化镁悬浊液：称取1.00g氧化镁，用蒸馏水定容到100mL。（现配现用）（6）7.5mol/L氢氧化钠溶液：称取30.00g氢氧化钠，用蒸馏水定容到100mL。（7）0.OlOOmolL盐酸标准溶液：用移液枪取0.42mL浓盐酸于烧杯中，用蒸馏水定容至500mL。标定方法：精确称取0.0200g分析纯

29、碳酸钠，用配好的盐酸溶液以0.1%甲基红乙醇溶液做指示剂滴定。重复标定3次，取平均值。计算公式：C（HCl）=2m/(MV×1000C（HCl）- 盐酸摩尔浓度，单位：molLm - 无水碳酸钠质量，单位：gM - 无水碳酸钠分子量 V - 盐酸滴定所消耗体积，单位：mL5.3 材料的处理5.3.1 仪器处理 用报纸将24个小烧杯口封好，用电热干燥器160oC灭菌2h，备用。5.3.2 新鲜猪肉的处理在比赛前48h，从三角市买来材料（猪肉和各100g），分别把三种材料各分为两份，每份50g，其中一份用5mg/mL胰蛋白酶抑制剂溶液浸泡5min，捞出沥干，然后放入已灭菌的烧杯中，用灭菌

30、的保鲜膜封住烧杯口；另一份不做任何处理，放入灭菌的烧杯中，用灭菌的保鲜膜封口，做好标签（编号方法：购回时间）；之后每隔12h（即在比赛前36h，24h，12h），又重复以上步骤，对新买来的材料做处理。注意事项：两种材料要同时做处理5.3.3 红豆的处理把红豆浸泡至膨胀6 实验操作步骤6.1红豆胰蛋白酶抑制剂PBS提取（1）称取25g红豆，以少量蒸馏水泡胀过夜（已处理）。(2磨成匀浆后加入4倍量PBS（0.05mol/L pH7.8）室温浸提2h，其间不断搅拌。(3以12000r/min离心15min，保留上清液。（4）以68°C热变性10min，迅速冷却，10000r/min离心15

31、min，保留上清液并量其体积。（5）加入固体硫酸铵至所需饱和度。4°C静置盐析1h。（6）12000r/min离心30min，收集沉淀，同时保留一部分上清液，沉淀以少量PBS（0.05mol/L pH7.8）溶解，用蒸馏水透析2h，得红豆胰蛋白酶抑制剂粗提取液。6.2 明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳6.2.1 不连续聚丙烯酰胺凝胶的制备（1）清洗玻璃板，用电吹风吹干；（2）在塑料胶条两面涂少量凡士林；（3）安装好电泳槽；（4）用烧杯按表3配封胶液，用滴管滴加于封口槽处，静置约5-10分钟直到凝固。（5）加入蒸馏水于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。（6）用小烧杯按表3配分

32、离胶，胶浓度15%，混匀，灌胶，高度离梳子约1-1.5cm,然后覆盖一层蒸馏水，凝胶时间为15-30分钟，胶与水分层，倾倒去蒸馏水。（7）用小烧杯按表3配浓缩胶，胶浓度5%，混匀，灌胶，插入梳子；（8）在凝胶过程中，液面下降，要补充胶液，凝胶时间约10-20分钟，凝好胶，拔掉梳子；（9）加入稀释的电极缓冲液，浸泡至上槽（低玻璃面），但不能高过下槽（高玻璃面），注意不能漏水。表5 聚丙酰胺凝胶配制方法试剂封胶分离胶（15%）浓缩胶（5%）蒸馏水6 mL1 mL1.5 mL30%凝胶贮液2 mL2.5 mL0.81 mL分离胶缓冲液PH8.801.3 mL0浓缩胶缓冲液PH6.8002.5 mL5

33、%明胶050L010%TEMED（四甲基乙二胺）200L100L100L10%AP（过硫酸铵） 100L50L100L总体积8.3mL5 mL5.01 mL凝胶时间5min15-20min10min6.2.2 电泳的过程（1）点样前，样品要加20%蔗糖20L以增加比重，同时加0.05%的溴酚蓝指示剂，按表4点样，用微量注射器点样。（2）将电泳槽上槽接（），下槽接（+），恒电压电泳：浓缩胶，80V约1h；分离胶160V，约3-4h。指示剂离下面胶剩1cm左右，再加跑1h。（3）剥胶。 表6胶孔号1234567891011体积（L）14.89.87.452.56.2.3 电泳活性染色和脱色（1）电

34、泳完毕，取出胶板置于培养皿，用去离子水冲洗数次，将胶切成5块，然后分别将胶板浸在含0.2mg/mL胰蛋白酶0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5的缓冲液中，37oC下保温酶解30min。（2）室温下用水漂洗酶解过的胶板5次。（3）漂洗完毕，用考马斯亮蓝R250染色液 50oC染色30min，回收考马斯亮蓝R250染色液（4）用去离子水洗去剩下的染色液，加入0.5mol/L NaCl洗脱液 70oC脱色0.5-2h。注意事项：（1）缓冲液的pH值 、浓度要准确配置，所用的水最好是双蒸馏水。 （2）30%凝胶贮液要避光保存，10%过硫酸铵（AP）要现配现用。（3）Acr、Bis的试剂要求

35、纯度较高，要求分析纯或是进口分装的。如果纯度不够，需要重结晶一次或两次，方可使用。6.3 胰蛋白酶抑制剂保鲜作用的研究6.3.1 外观指标观察观察不同处理猪肉，根据色泽、气味、粘度、弹性、新鲜度的指标记录在表7。6.3.2 挥发性盐基氮的测定方法 （1）样品处理将样品切碎搅匀，称取lOg，置于烧杯中，加100mL水，不停振摇，浸渍30min后过滤，滤液置冰箱(4OC中备用。（2）仪器的洗涤仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所有橡胶管、塞子须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次。（3） 安装好实验装置（如图1）图1安全管；蒸汽发生瓶；汽水分离管；反应瓶

36、；电炉；收集瓶；直形冷凝管；夹子（4）检查装置的气密性首先在蒸气发生瓶、反应瓶和号收集瓶中装入适量的蒸馏水，并夹好号夹子，使整套装置的各个出口都密封，且关掉冷凝管的进水口，插上电炉电源，微热蒸气发生瓶，若号锥形收集瓶有气泡产生，则证明装置气密性良好；反之，从左起，依次检查、是否漏气，重装装置。（5）制备水蒸气在水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸。加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。（6） 测定挥发性盐基氮含量将蒸气发生瓶和反应器分开，向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂56滴，并使冷凝管的下端插入液面下。吸取5OmL上述样品滤

37、液于蒸馏器反应室内，再加5.0mL 1 氧化镁混悬液，迅速塞紧塞子，接上蒸气发生瓶。由冷凝管中出现第一滴冷凝水开始计时，蒸馏5min。5min后提高接收瓶同时关掉电源，使冷凝管口离开硼酸液面约1厘米，并用蒸馏水洗涤冷凝管管口外面，继续蒸馏1min，移开接收瓶。用0OlOOmol/L盐酸标准溶液滴定吸取液。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇复现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇并观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在一分钟内不变，可视为已到达滴定终点。同时做空白实验 。注意事项：（1） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴

38、甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。（2）若空白对照液的接受瓶内溶液，5min后颜色不变或略有变化但尚未出现绿色，可以不滴定。（3）每次蒸馏完毕后，须将反应器洗涤干净，用pH试纸检测直形冷凝管的馏分，若pH为7.0时，证明清洗干净，反之重新洗涤。洗涤干净后方可进行下一次蒸馏操作。7 结果及计算7.1 明胶-PAGE图10min 20min 30min 40min 60min图2 0.1%明胶 13%凝胶 每孔点样10 uL 酶解时间为10min、20min、30min、40min、60min电泳5h（预实验电泳图）在前期预实验中，我们曾选择不同的凝胶浓度（分别为13%，15%），发现用1

39、3%凝胶浓度的凝胶只有在酶解10min时条带才较齐全（如图3），但是由于酶解时间过短，背景颜色较深。15%凝胶浓度的凝胶即使酶解30min，条带也较齐全，而且背景颜色较浅；此外，我们也改变过明胶浓度（如0.01%、0.05%、0.1%、0.5%），结果发现：过高的明胶浓度，会使背景颜色过深，并会出现拖尾现象；明胶浓度过低则会使条带颜色较浅，条带不齐全，但明胶浓度为0.05%的凝胶背景颜色较浅，而且条带颜色较深。综上所述，本次试验的电泳采用明胶浓度为0.05%,凝胶浓度为15%凝胶。 表6 红豆胰蛋白酶抑制剂明胶-PAGE各条带的相关参数编号12345点样量（L）14.89.87.45.02.5

40、每孔蛋白含量（g）1.080.720.540.360.18每孔抑活（U）6.04.03.02.01.01 2 3 4 5 图3 红豆胰蛋白酶抑制剂明胶-PAGE图（本次实验电泳图）注：明胶0.05%，分离胶15%，电泳时间5h，酶解时间30min，脱色时间90min ；由上到下条带依次命名为TI1至TI8如图3可知，编号分别为1、2、3、4、5的电泳带中，5号出现4条带；3、4号出现7条带；1、2号出现8条带, 预实验中每孔点样量(L（如表6）分别是14.8、9.8、7.4、5.0、2.5L ，每孔蛋白含量（g）分别为1.08、0.72、0.54、0.36、0.18，每孔抑活（U）6.0、4.

41、0、3.0、2.0、1.0，这说明点样量的多少也会影响某种蛋白酶抑制剂的活性，点样量多，则蛋白酶抑制剂的活性就高，也能分出更多条带，带型清晰可辨。点样量最高的1号带，其抑制活性也最高，而点样量最低的5号带，其活性最低，只能被染出4种胰蛋白酶抑制剂条带。在红豆中至少含有8种或以上的胰蛋白酶抑制剂，而且各种不同类型的胰蛋白酶抑制剂在红豆中的含量是不一样的，有些含量很少、有些含量多。在对红豆胰蛋白酶抑制剂的电泳鉴定实验中，通过改变凝胶的浓度、明胶浓度和酶解时间这些单一变量筛选出一种可行实用的明胶-PAGE方法，得出图3的电泳图。经过分析电泳图可以知道，红豆中TI5含量最多,活性最高，TI1含量最少，

42、活性最低。从编号1至5，胰蛋白酶抑制剂的点样量及其活性都呈递减趋势，这说明点样量与抑活有正相关关系。7.2 胰蛋白酶抑制剂与保鲜作用的关系7.2.1猪肉和在处理不同时间后的观感特性记录与分析7.2.1.1感官特性记录表7 猪肉新鲜度状况记录处理方式处理时间气味色泽弹性粘度新鲜度权重-0.40.30.20.11猪肉-0h10.0 9.7 10.0 10.0 9.9 猪肉浸泡12h4.7 8.7 7.7 9.7 7.0 对照4.0 5.7 3.7 9.0 4.9 猪肉浸泡24h1.7 4.0 5.7 3.7 3.4 对照2.3 3.0 4.0 4.0 3.0 猪肉浸泡36h0.0 1.0 0.7

43、0.0 0.4 对照1.0 1.0 2.0 1.7 1.3 猪肉浸泡48h0.0 0.0 0.3 0.0 0.1 对照0.0 0.3 0.0 0.0 0.1 经过3人组成的评分小组评分并计算出各项平均值，其中满分为10分，最好为10-9分；较好为8-6分；较差为5-2分最差为1-0分；6分以上为鲜度良好。然后按照权重计算出综合感官评定值（新鲜度）。7.2.1.2 感官特性的分析图4 由图可知，胰蛋白酶抑制剂处理过的猪肉在24h内其新鲜度要比对照的高。而超过24h后，胰蛋白酶抑制剂可能已经失活，对猪肉没有保鲜作用，所以图4中在24h-48h这个时间段对照的新鲜度比浸泡的高。7.3 猪肉和的挥发性盐基氮计算计算公式：T.V.B-N (m