第章蛋白质共价结构ppt课件

1、第第4章章 蛋白质的共价构造蛋白质的共价构造1 蛋白质通论蛋白质通论1.1 外形和大小外形和大小按外形和溶解度分类：按外形和溶解度分类：纤维状蛋白质：角蛋白、丝蛋纤维状蛋白质：角蛋白、丝蛋白、胶原蛋白白、胶原蛋白 不溶于水和稀盐溶液；构造不溶于水和稀盐溶液；构造作用。作用。球状蛋白质：球状蛋白质： 溶解性较好；溶解性较好；功能多样。功能多样。相对分子质量：相对分子质量：6000到到1x1061.2 构象和组织层次构象和组织层次v构型：具有一样构造式的立体异构体中取代构型：具有一样构造式的立体异构体中取代基在空间的相对取向。基在空间的相对取向。v不同的构型间的转变需求共价键的断裂和重不同的构型间

2、的转变需求共价键的断裂和重新构成。新构成。v构象：具有一样构造式和一样构型的分子在构象：具有一样构造式和一样构型的分子在空间里能够的多种形状。空间里能够的多种形状。v不同的构象间转变不需求共价键的断裂和重不同的构象间转变不需求共价键的断裂和重新构成。新构成。v蛋白质的天然构象：每一种蛋白质至少有蛋白质的天然构象：每一种蛋白质至少有一种构象在生理条件下是稳定的，并具有一种构象在生理条件下是稳定的，并具有生物活性的构象。生物活性的构象。构造层次：一级构造 1 primary structure)二级构造 2 secondary structure 超二级构造 supersecondary stru

3、cture 构造域 structural domain三级构造 3 tertiary structure四级构造 4 quarternary structure各个构造层次之间的关系可以作以下表示：各个构造层次之间的关系可以作以下表示：一级构造一级构造二级构造二级构造超二级构造超二级构造 构造域构造域三级构造三级构造四级四级构造构造1.3 蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性v催化催化 (酶酶)v调理调理 (激素、激活剂激素、激活剂v转运转运 血红蛋白、膜转运蛋白血红蛋白、膜转运蛋白v储存储存 卵清蛋白卵清蛋白v运动运动 肌动蛋白、肌球蛋白肌动蛋白、肌球蛋白v构呵斥分构呵斥分 角蛋白、胶原蛋白

4、角蛋白、胶原蛋白v防御和进攻防御和进攻 免疫球蛋白、蛇毒的溶血蛋白免疫球蛋白、蛇毒的溶血蛋白P161-162荧光素酶荧光素酶血红蛋白氧转运蛋白血红蛋白氧转运蛋白角蛋白角蛋白2 蛋白质的一级构造蛋白质的一级构造v一级构造一级构造 primary structure):v多肽链的氨基酸的序列。多肽链的氨基酸的序列。v主要衔接键：肽键主要衔接键：肽键 肽链中的氨基酸由于构成肽键时脱水，已不是完好的氨基酸，肽链中的氨基酸由于构成肽键时脱水，已不是完好的氨基酸，所以称为残基所以称为残基肽健肽健2.1 肽键和肽肽键和肽肽键：反式构型肽键：反式构型二肽二肽 三肽三肽 四肽四肽 寡肽寡肽oligopeptid

5、e 12个以上，个以上，20个以下氨基酸缩合而成个以下氨基酸缩合而成多肽多肽Polypeptide 20个以上氨基酸缩合而成个以上氨基酸缩合而成肽肽peptidepeptide ：由两个或两个以上的氨基酸经：由两个或两个以上的氨基酸经过肽键衔接而构成的化合物。过肽键衔接而构成的化合物。 肽链：氨基酸经过肽键衔接起来而构肽链：氨基酸经过肽键衔接起来而构成的链。成的链。H2NCHCR1OHNCHCR2OHNCHCR3OHNCHCOHRnO氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基N N端端游离的氨基游离的氨基C C端端游离的羧基游离的羧基肽健肽健肽健肽健肽单位肽单位肽链书写方式：从左到右，肽链书写方

6、式：从左到右，N端端C端端 命名：根据氨基酸组成，由命名：根据氨基酸组成，由N端端C端命名为端命名为 某氨酰某氨酰某氨酰某氨酰某氨基酸某氨基酸 丙氨酰谷氨酰甘氨酰赖氨酸丙氨酰谷氨酰甘氨酰赖氨酸AlaGlu-GlyLys (or AEGK)2.2 肽的化学性质肽的化学性质双缩脲反响：肽和蛋白质特有的。双缩脲反响：肽和蛋白质特有的。 含有两个或两个以上的肽键化合物与含有两个或两个以上的肽键化合物与CuSO4碱性溶液生成紫红色或蓝紫色碱性溶液生成紫红色或蓝紫色的复合物。的复合物。用分光光度计测定蛋白质含量。用分光光度计测定蛋白质含量。2.3 天然存在的活性肽天然存在的活性肽v活性肽活性肽active

7、 peptide:v有许多分子量比较小的多肽以游离形状存在，有许多分子量比较小的多肽以游离形状存在，通常都具有特殊的生理功能。通常都具有特殊的生理功能。 多肽激素多肽激素 多肽抗菌素多肽抗菌素 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸Ornithine, 缩写为 Orn。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽 脑啡肽脑

8、啡肽NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鹅膏覃碱的化学结构与真核生物的与真核生物的RNARNA聚合酶聚合酶和和结实结合结实结合 鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱v CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2CH2CH2CH2CHNH2CHNH2COOHCOOHCH2CH2SHSH 谷胱甘肽谷胱甘肽存在与动、植物及存在与动、植物及微生物中：微生物中： 1. 1.参与体内氧化复原反响参与体内氧化复原反响 2. 2.作为辅酶参与氧化复原作为辅酶参与氧化复原反响反响

9、 维护巯基酶或含维护巯基酶或含CysCys的的蛋白质中蛋白质中 SH SH的复原性的复原性 防止氧化物积累防止氧化物积累2GSH2GSHGS-SGGS-SG 谷胱甘肽谷胱甘肽3 蛋白质一级构造的测定蛋白质一级构造的测定 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质的多肽链拆分蛋白质的多肽链 断开多肽链内的二硫桥断开多肽链内的二硫桥 分析每一多肽链的氨基酸组成分析每一多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端残基末端残基 裂解多肽链成较小的片段裂解多肽链成较小的片段 测定个肽段的氨基酸序列测定个肽段的氨基酸序列 重建完好多肽链的一级构造重建完好多

10、肽链的一级构造 确定半胱氨酸残基间构成的确定半胱氨酸残基间构成的S-S交联桥交联桥位置位置Sanger于于1953年第一个测定氨基酸序列年第一个测定氨基酸序列 -牛胰岛素牛胰岛素insulin(获获1958年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖)DNFB(2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯) N末端末端2130蛋白质的蛋白质的N-末端或末端或C-末端残基的摩尔数和末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量3.1 测定蛋白质分子中多肽链数目测定蛋白质分子中多肽链数目3.2 拆分蛋白质的多肽链和断开多肽拆分蛋白质的多肽链和断开多肽链内的二硫桥链内的二硫桥非共价键：非共价键：血红蛋白四聚体血红蛋白四

11、聚体断裂：断裂：8mol/L尿素或尿素或6 mol/L盐酸胍盐酸胍二硫键：链内或链间二硫键：链内或链间复原：过量的复原：过量的- 巯基乙醇巯基乙醇pH89维护巯基：烷基化试剂碘乙酸维护巯基：烷基化试剂碘乙酸水解破坏肽健水解破坏肽健氨基酸混合物氨基酸混合物柱层析分别柱层析分别测定氨基酸测定氨基酸主要是酸水解，主要是酸水解，同时辅以碱水解同时辅以碱水解 3.3 氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析氨基酸组成：氨基酸组成： 用每摩尔蛋白质中含有氨基酸残基的摩尔数，用每摩尔蛋白质中含有氨基酸残基的摩尔数， 或每或每100g蛋白质中含有氨基酸的克数来表示。蛋白质中含有氨基酸的克数来表示。3.4 N末端和末端

12、和C末端氨基酸残基的末端氨基酸残基的鉴定鉴定 (1) N末端 2，4-二硝基氟苯DNFB)法* 丹磺酰氯DNS)法 苯异硫氰酸酯PITC)法* 氨肽酶法DNFB弱碱性溶液中弱碱性溶液中DNP-蛋白质蛋白质黄色化合物黄色化合物Sanger试剂试剂与蛋白质氨基发生反响与蛋白质氨基发生反响酸水解酸水解肽健断开，肽健断开，DNP-基不零落基不零落DNP-氨基酸能溶于氨基酸能溶于有机溶剂而与其他有机溶剂而与其他aa分别分别层析鉴定层析鉴定DNP-氨基酸氨基酸 2，4-二硝基氟苯二硝基氟苯DNFB)法法DNFBDNP-蛋白质蛋白质DNP-氨基酸氨基酸 丹磺酰氯法丹磺酰氯法DNS法法 原理与原理与DNFB法

13、一样法一样丹磺酰基有强荧光，灵敏度丹磺酰基有强荧光，灵敏度 比比DNFB法高法高100倍倍水解后水解后DNS-氨基酸不需提取氨基酸不需提取 直接用层析鉴定。直接用层析鉴定。(DNS-氨基酸氨基酸) 苯异硫氰酸苯异硫氰酸(酯酯)法法PITC法、法、Edman降解降解法法 PITC弱碱性条件下弱碱性条件下与末端氨基反响与末端氨基反响 PTC-肽肽PTH-氨基酸氨基酸酸性有机溶剂酸性有机溶剂加热加热层析鉴定层析鉴定特点：剩下的肽链仍是完好的。特点：剩下的肽链仍是完好的。每次只从蛋白质的每次只从蛋白质的N端解离和鉴定一个端解离和鉴定一个aa残基残基还可用来测定氨基酸序列还可用来测定氨基酸序列 氨肽酶法

14、氨肽酶法 肽链外切酶，从肽链肽链外切酶，从肽链N-N-末端逐个降解，释放出游离氨基酸。末端逐个降解，释放出游离氨基酸。AlaValGlyAla-Val-Gly局限性：酶对各种肽键敏感性不一样，经常难以判别氨基酸残基的顺序。局限性：酶对各种肽键敏感性不一样，经常难以判别氨基酸残基的顺序。(2) C末端末端 复原法复原法肼解法肼解法 羧肽酶法羧肽酶法C末端氨基酸末端氨基酸硼氢化锂复原硼氢化锂复原氨基醇氨基醇肽链水解肽链水解层析法鉴定层析法鉴定 硼氢化锂复原法硼氢化锂复原法 HNCHCOOHRLiBH4HNCHCH2OHR水解混合氨基酸H2NCHCH2OHR+C端 肼解法肼解法 多肽与肼在无水条件下

15、加热，可断裂一切的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用层析鉴定。 羧肽酶法羧肽酶法 肽链外切酶，从肽链肽链外切酶，从肽链C-C-末端逐个降解，释放出游离氨基酸。末端逐个降解，释放出游离氨基酸。反响时间反响时间氨基酸释放量氨基酸释放量3.5 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分别纯化多肽链的部分裂解和肽段混合物的分别纯化 酶裂解法酶裂解法*：酶的专注性：酶的专注性A 胰蛋白酶胰蛋白酶( Trypsin： R1=赖氨酸、精氨酸赖氨酸、精氨酸 但但R2=脯氨酸抑制脯氨酸抑制B 胰凝乳蛋白酶糜蛋白酶：胰凝乳蛋白酶糜蛋白酶： R1=苯丙氨酸、色苯丙氨酸、色氨

16、酸、酪氨酸氨酸、酪氨酸但但R2=脯氨酸抑制脯氨酸抑制C 嗜热蛋白酶：嗜热蛋白酶： R2=亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸D 胃蛋白酶胃蛋白酶: R1和和R2=苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸酪氨酸 溴化氰溴化氰CNBr:只断裂只断裂Met的羧基构成的肽健的羧基构成的肽健Met残基残基高丝氨酸内酯残基高丝氨酸内酯残基 化学裂解法：化学裂解法：3.6 肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定v肽部分水解后，降解生长短不一的小肽段，用层析或电肽部分水解后，降解生长短不一的小肽段，用层析或

17、电泳分别，然后测序。泳分别，然后测序。v Edman化学降解法化学降解法PITCv1950年年Edman P.首先提出首先提出v多肽的游离末端多肽的游离末端NH2+ PITC PTC-多肽多肽 (PTC-氨基氨基酸酸)v环化环化PTH -氨基酸氨基酸+减少一个残基的肽减少一个残基的肽 根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法v多用两种水解方法降解，得到两套肽段，经两套肽多用两种水解方法降解，得到两套肽段，经两套肽段序列的重叠拼接得到整个肽链全长序列。段序列的重叠拼接得到整个肽链全长序列。3.7 肽段在多肽链中次序的决议肽段在多肽链中次序的决议第一套肽段第一套肽段OUSPSEOVERLAHO

18、WT第二套肽段第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO末端残基末端残基 H S末端肽段末端肽段 HOWT APS溴化氰溴化氰胰蛋白酶胰蛋白酶DNFB38N:(E) Glu断开二硫键断开二硫键K：LysR：ArgM：MetC:(D)Asp3.8 二硫桥位置确实定二硫桥位置确实定胃蛋白酶水解胃蛋白酶水解(专注性低，切点多；作用专注性低，切点多；作用pH2防防止二硫键发生交换反响止二硫键发生交换反响 Brown及及Hartlay的对角线电泳技术的对角线电泳技术过甲酸断裂二硫键过甲酸断裂二硫键对角线电泳对角线电泳4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能蛋白质的氨基酸序列与生物功能同源蛋白质的物种差别与生物进

19、化同源蛋白质的物种差别与生物进化同源蛋白质：在不同生物体中行使一样同源蛋白质：在不同生物体中行使一样或类似功能的蛋白质。或类似功能的蛋白质。 氨基酸序列同源氨基酸序列同源 ，如血红蛋白。，如血红蛋白。 不变残基、可变残基不变残基、可变残基细胞色素细胞色素c：含血红素的电子转运蛋白。：含血红素的电子转运蛋白。 存在于一切真核生物的线粒体中。存在于一切真核生物的线粒体中。28个个不变残基。不变残基。v 两个物种的同源蛋白质的序列间的氨基酸差两个物种的同源蛋白质的序列间的氨基酸差别数目与这些物种间系统发生差别是成比例别数目与这些物种间系统发生差别是成比例的。的。v细胞色素细胞色素cv 人与黑猩猩人与

20、黑猩猩0；v 人与其他哺乳动物人与其他哺乳动物10；v 人与酵母人与酵母40以上。以上。l系统树：分析细胞色素系统树：分析细胞色素c序列并找出衔接分支的最小突变残基数的方法。序列并找出衔接分支的最小突变残基数的方法。5 肽和蛋白质的人工合成肽和蛋白质的人工合成v1958年，北京大学生物系在国内初次合成具年，北京大学生物系在国内初次合成具有生物活性的八肽有生物活性的八肽-催产素。催产素。v1965年年9月，中国科学院生物化学研讨所、月，中国科学院生物化学研讨所、有机化学研讨所和北京大学化学系协作，在有机化学研讨所和北京大学化学系协作，在世界上初次人工合成了结晶牛胰岛素。世界上初次人工合成了结晶牛

21、胰岛素。肽的人工合成肽的人工合成v液相合成法液相合成法v N端端C端端v 氨基和羧基维护剂及激活剂氨基和羧基维护剂及激活剂v 固相肽合成固相肽合成液相合成法液相合成法1 1一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基被维护基封锁被维护基封锁羧基维护基羧基维护基(Z)：甲酯：甲酯CH3O-、乙酯、乙酯C2H5O- 在室温下皂化除去在室温下皂化除去维护基：接肽时起维护作用，维护基：接肽时起维护作用， 接肽后容易除去，又不引起肽健断裂。接肽后容易除去，又不引起肽健断裂。氨基维护基氨基维护基(Y)：苄氧甲酰基：苄氧甲酰基Cbz 可用催化加氢或用金属钠在液氨中处置除去可用催化

22、加氢或用金属钠在液氨中处置除去2 2在缩合剂作用下缩合构成二肽在缩合剂作用下缩合构成二肽 ( (肽键不能自发构成肽键不能自发构成) )缩合剂：缩合剂：N，N-二环己基碳二亚胺二环己基碳二亚胺DCC 3 3接肽完成后除去维护基接肽完成后除去维护基缺陷：步骤多，产率低缺陷：步骤多，产率低 固相肽合成固相肽合成 1 1第一个氨基酸第一个氨基酸(N(N端被维护端被维护) )的羧基端先和的羧基端先和( (氯甲氯甲基聚苯乙烯基聚苯乙烯) )树脂反响，构成苄酯。树脂反响，构成苄酯。3 3第二个氨基酸氨基预先用叔丁氧甲酰基维第二个氨基酸氨基预先用叔丁氧甲酰基维护护, ,以以DCCDCC为缩合剂，接在第一个氨基

23、酸的氨基上。为缩合剂，接在第一个氨基酸的氨基上。反复这个方法。反复这个方法。 4 4最后使多肽与树脂分别，同时除去维护基。最后使多肽与树脂分别，同时除去维护基。2除去该氨基酸除去该氨基酸N端的维护基端的维护基固固相相肽肽合合成成挂接挂接去去维维护护活化羧基活化羧基氨基维护氨基维护缩合缩合断裂与去维护断裂与去维护Exercisev由以下信息求八肽的序列。由以下信息求八肽的序列。va酸水解得酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val；vbSanger试剂处置得试剂处置得DNP-Ala；vc胰蛋白酶处置得胰蛋白酶处置得Ala，Arg，Thr 和和 Leu，Met，Phe，2Val，当以，当以Sanger试剂处置时分别得试剂处置时分别得到到DNP-Ala和和DNP-Val；vd溴化氰处置得溴化氰处置