激光共聚焦显微镜样品制备方法

1、 电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷图I气体CO:冷冻装置。Fig.1Gas C02frozen equipment.镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。冷冻包埋模具见图2。图2冷冻包埋模具。Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻

2、切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20以下中直接冷冻。3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口。反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。4荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoresein isothiocy

3、anate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC,ex550nm/em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin acetic acid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。如Cyanine类荧光染

4、料,其中Cy3 (ex554nm/em568nm的激发峰值更接近于新型固体561am激光器,且比TRITC等更亮、更稳定,已被广为应用于免疫荧光抗体标记旧1;Alexa Fluor系列荧光染料激发和发射光谱窄,可用于多重荧光标记而更少光谱重叠;ATTO系列荧光染料具有较强的光稳定性和热稳定性,已被应用于STED (Stimulated Emission Depletion受激发射损耗超高分辨率显微成像技术1;DyLigh、CF等更多新型荧光染料系列都将因其较高的激发效率、良好的光稳定性、宽泛的PH稳定性等优越的特性而被广泛的应用于组织及细胞免疫荧光标记。组织切片的细胞核标记目前仍然采用DAPI

5、(4, 6一联脒一2-苯基引哚,ex359nm/em461am,其特点是专一性强、灵敏度高、稳定性好、毒性小,且可被405am激光器有效地激发,获取明亮的核标记荧光图像。PI(碘化丙啶ex536am/em617llm也可以用于核标记,因其可识别DNA和RNA,核染色前须进行适当的RNA酶处理。TOTO系列、YOYO系列荧光染料也可作为组织细胞核荧光染料。表达荧光蛋白的组织经冷冻切片制样后,可直接封片,观察并扫描图像,也可配合使用其它荧光染料进行免疫荧光抗体标记和核染色。同时表达GFP和RFP荧光蛋白的组织切片,如还需作免疫荧光抗体标记,应选择可以被633am和405nm波长激光器激发的荧光染料

6、,如CY5、Alexa fluor633和Alexa fluor405等。5样品制备中相关实验方法 用于免疫荧光抗体标记组织切片的载玻片需 激光共聚焦显微镜样品制备方法(二组织切片样品作者:边玮, BIAN Wei作者单位:中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海,200031刊名: 电子显微学报英文刊名:JOURNAL OF CHINESE ELECTRON MICROSCOPY SOCIETY年,卷(期:2010,29(4参考文献(5条1.斯佩克特 D L.戈德曼 R D.莱因万德 L A.黄培堂细胞室验指南 20052.余礼厚激光共聚焦显微镜样品制备方法(一细胞培养样品 2010(23.汪尔康生命分析化学 20064.Punge A.Rizzoli S O.Jahn R3D reconstruction of hig