白细胞介素8-251位点基因多态性与呼吸道合胞病毒毛细支气管炎及毛细支气管炎后婴幼儿喘息的关系

1、白细胞介素8-251位点基因多态性与呼吸道合胞病毒毛细支气管炎及毛细支气管炎后婴幼儿喘息的关系?856?生1月第45卷第11期ChinJPediatr.November2007.V0145.N0.11白细胞介素8-251位点基因多态性与呼吸道合胞病毒毛细支气管炎及毛细支气管炎后婴幼儿喘息的关系田曼赵德育文惯宇施圣云陈荣华【摘要】目的探讨IL?8启动子-251A/T基因多态性与呼吸道合胞病毒(RSV)致毛细支气管炎(简称毛支)及毛支后婴幼儿喘息的相关性.方法应用聚合酶链反应.限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术检测320例RSV毛支患者及272例正常对照者IL-8基因.251A/T多态性,

2、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-8,IgE浓度.并对人组的毛支患儿随访3年,记录婴幼儿毛支后喘息再发的情况.结果(1)RSV毛支组和对照组IL-8-251位A等位基因频率分别为45.6%,37.7%,两组问比较差异有统计学意义(P<0.05);(2)基因型tit,AT,AA的毛支患儿血清IL-8浓度分别为(176)ng/L,(217)ng/L,(249)ng/L,三种基因型间比较差异有统计学意义(P<0.01);(3)RSV毛支后喘息组和未再喘息组IL-8-251位A等位基因频率分别为54.6%,35.8%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论IL-

3、8启动子-251A/T基因多态性与RSV毛支易感性相关,且携带IL-8-251A等位基因的患儿在RSV毛支后更容易出现喘息.【关键词】白细胞介素8;多态现象(遗传学);呼吸道合胞体病毒感染;细支气管炎;呼吸音Associationbetweeninterlenkin41gene-251locuspolymorphismandrespiratorysyncytlalvirusbronchiolitisandpost.bronchiolitiswheezingininfantsTIANMan,ZHA0De.yu,WENGuan.yu,SHIShengyun,CHENRonghuaDepartmen

4、tofRespiratoryMedicine.TAffiliatedNanjingChildrensHospitalofNanfingMedicalUnhers,Nanjing210008,ChinaCorrespondingauthor:Z0Deyu(Email:zhaodeyu98)【Abstract】ObjectiveRespiratorysyncytialvirus(RSV)infectsnearlyallchildrenundertwoyearsofage.Itisnotunderstoodwhysomedevelopseriousbronchiolitis.WhetIlerther

5、eisageneticcomponentisnotknown.ThenatureoftheassociationbetweenRSVerleukin.8(IL.8)isapotentneutrophilchemokineandactivator.whichplaysaroleinvirus.inducedwheezingdiseases.ThepurposeofthisstudywastoassessthegeneticassociationbetweentheIL-8genepromote

6、r-251A/TpolymorphismandRSVbronchiolitisandpost-bronchiolitiswheezinginchildren.MethodsTotally320childrenwhowerehospitalizedforbronchiolitistogetherwithpositiveimmunofluorescenceforRSVwererecruitedinthisstudyfromJan.2002toJan.2004.Agroupof272healthychildrenwereenrolledascontrols.Theageofthesechildren

7、rangedfrom1to12months.Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP)wasusedtoidentifythepolymorphismatposition-251oftheIL.8promoterinRSVbronchiolitisandcontrolgroups.ThetotalIL-8andIgEconcentrationsinserumsamplesweremeasuredbyenzyme.1inkedimmunosorbentassay(ELISA).Thepatient

8、swithRSVbronchiolitiswerefolloweduDinordertoanalyzetIleoccurrenceofwheezingpost-bronchiolitis.Results(1)BothAalleleandTalleleweredetectedat-251oftheIL?8promoter;theprevalenceoftheAalleleinRSVbronchiolitisgroupwas45.6%.ascomparedwith37.7%innormalgroup.TheprevalenceofIL-8-251Aallelewassignificantlydif

9、ferentbetweenthetwogroups(P<0.05).(2)ForgenotypesT/T.A/T,A/AinRSVbronchiolitis,levelofserumIL-8were(176)rig/L,(217)ng/L,(249)ng/L,respectively,thedifferencewassignificantamongthethreegenotypes(P<0.01).(3)TheprevalenceoftheAalleleinthegroupwhowheezedaftertheepisodeofRSVbronchiolitiswas54.6%,asc

10、omparedwith35.8%inthegroupwhohadbronchiolitisbutdidnotgoontowheeze.TheprevalenceofIL-作者单位:210008南京医科大学附属南京儿童医院呼吸内科(田曼,赵德育),病毒室(施圣云);南京医科大学儿科研究所(文惯宇,陈荣华)通信作者:赵德育(Email:zhaodeyu98126.corn).论着中华儿科杂志2007年11月第45卷第11期ChinJPediatr,November2007.Vol45.No.118-251Aallelewassignificantlydifferentbetweenthetwogr

11、oups(P<0.05).ConclusionPolymorphismofIL-8promoter?251A/TwasassociatedwithsusceptibilitytoRSVbronchiolitisinchildren.TheassociationofIL-8-251AwithsevereRSVbronchiolitisismostmarkedinthechildrenwhogoontowheeze.【Keywords】Interleukin-8;Polymorphism(genetics);Respiratorysyncytialvirusinfectiion;Bronch

12、iolitis;Respiratorysounds2岁以下儿童几乎均感染过呼吸道合胞病毒(RSV),为什么只有少部分患儿发展为比较严重的毛细支气管炎(简称毛支),造成这一现象的确切机制尚不清楚,遗传因素可能影响了患儿对RSV感染的反应.毛支后婴幼儿易发生反复喘息,我们对入组的毛支患儿随访3年,记录婴幼儿毛支后喘息再发的情况,探讨婴幼儿喘息发生的原因.婴幼儿喘息和呼吸道病毒感染相关,由中性粒细胞介导的炎症反应在其发病机制中发挥重要作用_2.IL-8属于趋化因子家族,可以趋化和激活中性粒细胞,发生脱颗粒和呼吸爆发反应.IL.8基因启动子区起始位点.251位多态性能影响其转录活性,是被广泛研究的位点

13、.2002年1月一2007年1月我们收集RSV毛支患JLt,周血,测定IL.8.251位点基因型,并进行随访,探讨IL.8启动子.251位基因多态性对RSV毛支患儿和毛支后喘息的影响.对象和方法一,研究对象RSV毛支组:320例,男248例,女72例,年龄112(5.72.5)个月.均为南京市儿童医院呼吸科2002年1月至2004年1月收治的毛支住院患儿.诊断标准参照文献3.取患儿住院后鼻咽分泌物,直接免疫荧光法检测RSV抗原,阳性者纳入RSV毛支组.确认无早产,先天性心脏病,慢性肺疾病,既往无喘息史.正常对照组:272例,其中男160例,女112例,年龄112(6.12.5)个月.均为南京市

14、儿童医院营养保健科体检的健康儿童,近两周内无上呼吸道感染史,无喘息史.各组受检者均为无血缘关系的中国汉族人.二,实验方法1.主要试剂和仪器:DNA提取试剂盒购自Promega(美国),聚合酶链反应(PCR)试剂购自Promega(上海),限制性内切酶VspI购自大连宝生物工程公司,人IL.8,IgE检测试剂盒购自深圳晶美公司.酶标仪为博赛,扩增仪为Biometra.PCR引物由上海英俊生物有限公司合成.2.标本的采集:取受试者外周静脉血3ml,其中1ml乙二胺四醋酸(EDTA)抗凝后,用基因组DNA提取试剂盒提取白细胞基因组DNA,一20cc冻存;余2m1分离血清,分装后一20C冻存待用.3.

15、血清IL?8,IgE浓度测定:所有受试者均采用人IL-8检测试剂盒,用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中IL.8浓度.4.聚合酶链反应.限制性片段长度多态性(PCR-RFLP):PCR扩增引物序列为:上游:5.CCATCATGATAGCATCTGTA-3下游:5?CCACAAqq3”GGTGAATTATTAA-3扩增片段长度为174bp;下游引物的倒数第3个碱基由原序列的C改为T,从而在PCR产物中构成了能被限制性内切酶VspI酶切的惟一位点.反应体系含0.5g基因组DNA,3mmolMgC12,2mmoldNTP,上下游引物各3pmol,TaqDNA聚合酶1.5u,10PCR缓冲液(不

16、含Mg)2,反应体系为20l,置于PCR仪中.首先95cc预变性5min,然后94cc30S,58.5C退火40S,72oC延伸30S,共32个循环,最后72cc延伸7min.取PCR扩增产物5l,VspI限制性内切酶2u,总体系为10l,37cc水浴箱中孵育过夜酶切,3%琼脂糖电泳鉴定基因型.3种基因型各随机选取部分目的DNA送至上海英俊生物有限公司直接DNA测序,验证PCR-RFLP的准确性.5.收集并整理入选受检儿童的临床资料,随访3年:对符合RSV毛支组纳入标准的受检者,详细记录其性别,年龄,喂养方式,家中是否有宠物,住院时间,入院时血氧饱和度(SaO),特应性体质史(湿疹,鼻炎或食物

17、,药物过敏史)及特应性家族史等.并对这批患儿进行随访,记录患儿3年内毛支后喘息再发的情况.6.统计学分析:采用SPSS11.5软件包进行分析.研究对象基因型与Hardy-Weinberg平衡的符合程度,组间人群基因型与等位基因频率的比较均采用x检验.不同基因型之间血清IL.8浓度采用方差分析.结果一,血浆IL-8浓度测定2007年11月第45卷第11期ChinJPediatr,November2007.Vol45.No.11毛支组患儿血浆IL一8浓度为(20.37.5)ng/L,对照组儿童血浆IL-8浓度为(7.22.4)ng/L.两组之间血浆IL一8浓度比较差异有显着性(t=27.4,P&l

18、t;0.01),毛支患儿血浆IL-8水平明显升高.二,HardyWeinberg平衡检测RSV毛支组和对照组-251A/T基因型分布均符合HardyWeinberg平衡(P>0.05),说明所选人群具有群体代表性.三,RSV毛支组和对照组-251A/T基因型及等位基因频率比较两组人群-251A/T基因型及等位基因频率比较(表1),差异有统计学意义.四,不同基因型RSV毛支患儿血清IL一8浓度比较3种基因型RSV毛支患儿血清IL-8浓度比较(表2),差异有统计学意义(F=13.87,P<0.01).五,随访结果本研究随后对320例毛支患儿进行了为期3年的随访,记录患儿在毛支后3年喘息

19、再发的情况.结果失访者38例,喘息病史不详者14例,毛支后再发喘息者198例,未再发生喘息者70例.再发喘息组中被动吸烟者和家有宠物者共57例,未再喘息组共有17例.在排除被动吸烟和家有宠物这两个可能与喘息相关的环境影响因素外,将IL一8不同基因型与RSV毛支后喘息的关系做了比较,结果显示两组人群IL一8-251三种基因型(TT,TA,AA)频率分布差异有统计学意义(x=14.82,P<0.01),且两组A等位基因频率分别为54.6%,35.8%,差异有统计学意义(x=5.42,P<0.05)(表3).讨论IL一8是一种分子量为800010000的多肽,可以趋化中性粒细胞和T淋巴细

20、胞在气道黏膜聚集,激活中性粒细胞使其释放超氧化物,溶酶体酶,产生炎症反应.RSV毛支患儿的支气管肺泡灌洗液的IL一8明显含量增加.人IL一8基因定位于染色体表2不同基因型RSV毛支患儿血清IL-8浓度比较表3RSV毛支后喘息组和未再喘息组-251AFT基因型及等位基因频率比较基因型频率(%)组别例数1.I1TAAA等位基因频率(%)TA4q12一q21,编码IL一8的基因在其转录起始点-251处存在基因多态性(A/T),通过转录调控影响IL一8的合成,在基因水平发挥着调节作用.IL一8-251T/A基因多态性与人类多种疾病相关引,提示IL一8-251位点多态性与疾病的遗传易感性密切相关.体外研

21、究表明IL一8251基因多态性与IL一8产量有关j.本研究结果显示,RSV毛支组IL一8基因一251TT,AT,AA三个基因型频率分别为:28.1%,52.5%,19.4%,对照组三个基因型频率分别为:38.6%,47.4%,14.0%,经检验两组基因型分布均符合HardyWeinberg平衡,说明所选样本具有群体代表性.两组间基因型及等位基因频率比较差异有统计学意义,RSV毛支患儿IL一8等位基因IL一8-251A频率明显增高.该结果与英国学者Hull等的研究结果一致.IL一8-251T/A基因多态性与RSV毛支易感性相关,这种遗传差异可能导致RSV感染后的疾病严重程度不同.RSV毛支组患儿

22、血清IL一8浓度显着高于对照组,不同基因型RSV毛支患儿血清IL一8浓度比较,差异有显着性.结果提示,IL-8-251T/A基因多态性能增加IL一8的转录,加大了RSV毛支的易感性.血清IL一8水平增高,系局部合成分泌增多释放人血所致.表1RSV毛支组和对照组-251A/T基因型及等位基因频率比较中华儿科杂志2007年l1月第45卷第ll期ChinJPediatr,November2007.Vol45.No.1lRSV毛支后患儿易发生再次喘息,许多流行病学研究已证实了这点引.可能的因素有以下几点:(1)RSV感染会破坏气道黏膜上皮,影响肺的发育.(2)RSV作为变应原引起气道变应性炎症,使气道

23、产生高反应性,并持续较长时间.(3)某些遗传因素决定了患儿在病毒感染后易出现喘鸣,RSV毛支往往是早期表现.本研究发现,携带IL.8-251A等位基因的患儿在RSV毛支后更容易出现反复喘息,提示IL.8251A等位基因可能是导致宿主RSV毛支后喘鸣的一个常见标记.早期儿童喘息性疾病多由病毒感染引起,气道有大量中性粒细胞浸润_l.,IL.8启动子区一25lA基因多态性可以通过使IL.8分泌增加来促进该炎症反应.这与英国Goetghebuer等的研究相同,该研究发现在幼年患严重RSV毛支随后又出现反复喘鸣的儿童当中,IL-8基因变异传递比预期值显着常见,在未出现反复喘息的儿童中并没有发现这一影响.

24、研究报道IL-8启动子区25lT基因型与哮喘呈正相关,与RSV毛支呈负相关,这可能暗示这两种疾病具有不同的遗传因素,提示婴幼儿的喘息性疾病和儿童哮喘存在差异.临床工作中也发现,包括引起喘息的病因,临床症状和对治疗药物的反应,两者均有差异.早期儿童毛支后喘息多与病毒感染有关,而儿童哮喘大多与特异性体质相关.婴幼儿喘息性疾病在临床中占很大比例,目前进行的独立研究较少,有必要对其本质有进一步认识.我们的研究证实,IL-8-251A与RSV毛支及毛支后婴幼儿喘息有关,这并不排除该多态与lL-8基因上其他的多态连锁不平衡所致.只有整体研究IL.8基因多态性,才能正确评价其在儿童早期喘息疾病中的作用.另外

25、,有其他候选基因的基因多态性,如IL4,ILl0等也与RSV毛支有关,我们今后会对单个基因的观察扩展至多个基因的联合研究,将具有更大的临床价值.参考文献1MolerF,OhmitS.Severityofillnessmodelsforrespiratorysyncalvirus-associatedhospitalization.AmJRespirCritCareMed.1999.159:1234-1240.2LeBourgeoisM,GoncalvesM,LeClaincheL.eta1.Bronchoalveolarcellsinchildren<3yearsoldwithsever

26、erecurrentwheezing.Chest,2002,122:791-797.3江载芳,申昆玲.毛细支气管炎/胡亚美,江载芳.诸福棠实用儿科学.7版.北京:人民卫生出版社.2002:1199.1120.4McNamaraPS,FlanaganBF,HartCA,eta1.Productionofchemokinesinthelungsofinfantswithsevererespiratorysyncytialvirusbronchiolitis.JInfectDis.2005.191:1225.1232.5JiangZD,OkhuysenPC,GuoDC,eta1.Geneticsus

27、ceptibilitytoenteroaggregativeEscherichiacolidiarrhea:polymorphismintheinterleukin-8promotorregion.JInfectDis,2003,188:506-511.6OhyauchiM,ImataniA,YonechiM,eta1.Thepolymorphisminterleukin8-251A/TinfluencesthesusceptibilityofHelicobacterpylorirelatedgastricdiseasesintheJapanesepopulation.Gut,2005,54:330-335.7HullJ,ThomsonA,KwiatkowskiD.Associationofrespiratorysyncalvirusbronchiolitiswiththeinterleukin8generegioninUKfamilies.Thorax,2000,55:1023-1027.8LazzawT,HoggG,BarnettRespiratorysynciMvirusinfectionandrecurrentwheeze/asthmainc