血浆游离DNA(ctDNA)提取标准操作规程

1、血浆游离DNA提取标准操作规程1.目的：制定DNA提取标准操作规程，使尽可能多提取到血浆游离DNA。2.适用范围：血浆提取。3.术语及定义：无。4.职责：4.1 文件编写：高通量实验室技术员。4.2 文件审核：高通量实验室组长。4.3 文件审批：实验室主任。4.4 执行：高通量实验室的所有工作人员。5.操作规程：5.1准备工作5.1.1紫外杀菌：打开超净工作台内的紫外灯，杀菌30 min，关闭紫外灯，打开抽风机，通风10 min。5.1.2实验前准备：通风结束后，根据实验室安全防护规程中的相关规定，换好洁净服、洁净帽、防护镜等进入实验室；将恒温金属浴打开至56，将恒温水浴锅打开至60。5.1.

2、3准备物品：准备1.5 mL及2.0 mL的EP管，50mL离心管，96孔双面板，1000L、200L、100L、20L、和10L移液枪和枪头，游离核酸提取试剂盒（离心柱法）。5.1.4试剂准备及配制：5.1.4.1无水乙醇，异丙醇。5.1.4.2每管Carrier RNA（干粉）中各加入1550L的洗脱液（AVE），充分混匀，溶解。-20保存（Carrier RNA为白色或半透明物质，请确保其完全溶解；反复冻融不可超过三次，可分装保存避免反复冻融）。5.1.4.3每瓶AW1加入25mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。5.1.4.4每瓶AW2加入30mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾

3、，室温保存。5.1.4.5每瓶ACB加入200mL的异丙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。5.1.4.6 Buffer AL与Carrier RNA进行混合，配制成裂解工作液(现配现用)1人份12人份24人份Buffer AL0.9 mL10.6mL21.1mLCarrier RNA5.6L67.5L135L5.1.5真空泵准备依次将Luer slot of the QIAvac 24 Plus (closed with luer plug)、开关阀、连接器、吸附柱、扩展管装到真空泵底座上（装紧以防止漏气）。5.2 DNA提取流程5.2.1在50mL的离心管内加入100L的蛋白酶K。5.2.2

4、取1.0mL样本加入离心管中。5.2.3再加入800L的裂解工作液，震荡30秒，瞬时离心。60恒温水浴锅温育30分钟。5.2.4加入1.8mLACB，震荡15秒，瞬时离心，冰上孵育5分钟。5.2.5将混合液全部转移至吸附柱，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压力降至0，小心移去扩展管。5.2.6加入600L的抑制物去除液(ACW1)，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压力降至0。5.2.7加入750L的去离子液(ACW2)，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压力降至0。5.2.8加入750L的无水乙醇，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压

5、力降至0，盖紧管盖。5.2.9将吸附柱取出，放置于2.0mL EP管于室温下14000rpm（最大转速）离心3分钟。5.2.10将吸附柱取出，放置于新的2.0mLEP管。打开管盖，56放置2分钟。5.2.11将吸附柱取出，放置于新的1.5mLEP管，在吸附柱膜的正上方小心加入50L洗脱液（AVE），盖紧管盖，室温静置3分钟，14000rpm离心1分钟。5.2.12 EP管内即为提取后的核酸，可立即使用或置于-20±5待用。5.3 样本的质控标准提取好的DNA样本，使用Qubit3.0荧光计检测其浓度，浓度在2ng/L以上为合格，可用于后续的文库构建，若DNA浓度小于2ng/L，则需重新进行DNA的提取。6.注意事项：6.1实验步骤较多，每一步实验开始前都要做好准备工作，每一步实验结束后先清理前面的试剂耗材，再进行下一步操作。6.2实验过程中除使用仪器时在超净台外工作，其它一切工作都要在超净台中操作；6.3处理过程中产生的垃圾必须扔到专用的黄色医疗垃圾袋中，黄色医疗垃圾袋必须扔到首二层垃圾房的黄色垃圾桶中；6.4所有离心步骤均在室温下进行，15-25；6.5实验完毕用10%次