喷雾干燥技术在蛋白_多肽类药物微球制备中的应用

1、接受日期 20072042123 通讯作者 : 何应 , 副教授 ;研究方向 : 控释和靶向制剂及新药研制开发 ;T el :022227403913; E 2m ail :heyingxm163. com喷雾干燥技术在蛋白、 多肽类药物微球制备中的应用白 洁 , 何 应3(, 摘 要 , 多肽类药物微球的研究进展 , 喷雾干燥、 喷雾冷冻干燥、 喷雾液中冷冻及低温喷雾提取等制 关键词 ; ; ; 壳聚糖 ; 蛋白 ; 多肽中图分类号 R97716;R94419 文献标识码 A 文章编号 1001-5094(2007 07-0298-05Application of Spray Drying

2、T echnique to Preparation of Protein 2and Peptide 2loaded M icro spheres :a ReviewBAI Jie , HE Y ing(School o f Pharmaceuticals Science and T echnology , Tianjin Univer sity , Tianjin 300072, China Abstract According to different kinds of comm on carrier materials :P LA , P LG A and chitosan , the a

3、dvances in application of spray drying technique to preparation of protein 2and peptide 2loaded microspheres were reviewed classifiedly. And the characteristics of major spray drying techniques , such as s olution spray 2drying , emulsion spray 2drying , spray freeze drying , spray freezing into liq

4、uid and cry ogenic spray extraction , were introduced and com pared.K ey w ords S pray drying ; Microspheres ; P LA ; Chitosan ; Protein ; P olypeptide 随着 DNA 重组技术的发展 , 越来越多的蛋白类药物被开发出来 , 现已有多种蛋白类药物获美国 FDA 批准并上市 。 但是 , 由于蛋白 、 多肽类物质普遍 具有稳定性差 、 生物利用度低 、 体内生物半衰期短等 缺点 , 使它们在治疗学领域的应用受到很大限制 。 通常应用适当的载体材料对这

5、类物质进行微囊化而 提高其稳定性 。 复乳溶剂蒸发法是目前实验室研究 阶段普遍采用的微囊化方法之一 , 但是在此过程中 产生的机械应力 、 剪切力和溶剂化会导致聚集 , 从而 造成蛋白质天然结构的改变和生物活性的丧失 , 而 且此方法不适合应用于工业化大生产 。喷雾干燥技术则是一种快速的一步微囊化过程 , 其条件温和 , 制得的微球具有粒度分布窄 、 包封 率高等特点 , 其用于不稳定药物微囊化的大规模生 产极具潜力 。 目前 , 应用该技术生产的重组人生长 激素 (rhGH 聚乳酸 (P LA -聚羟乙酸 (PG A 共聚物(P LG A 微球制剂 Nutropin Depot T M 已获

6、准上市 , 并有多种蛋白 、 多肽类药物的缓释微球尚处于研究阶段 。 本文按照不同的常用载体材料 (聚乳酸类和壳聚糖 类 , 分类综述应用喷雾干燥技术制备蛋白 、 多肽类 药物微球的研究进展 。综述与专论 2007年第 31卷 第 7 期 第 298 页 298 2007, Vol . 31, No . 7 Progress in Pharmaceutical Sciences 1 聚乳酸类生物可降解聚合物 , 如 P LA 和 P LG A 已成功应 用于喷雾干燥法制备蛋白 、 多肽类药物微球 , 并能使 制剂具缓释功效 。 111 喷雾干燥法 11111 溶液 喷雾干燥法 (S oluti

7、on S pray 2drying 该方法通常选用醋酸作为加料液 , 将蛋白 、 物与 P LA 或 P LG A 共溶于醋酸溶液中 , 嘴进行喷雾干燥 。Prieto 等 1体材料 (和 P LG A 对生长抑素类 似物 伐 普 肽 进 行 微 化 , 即 将 质 量 分 数 分 别 为 015%和 5%的伐普肽和聚合物共溶于 40m L 醋酸 中 , 将此溶液以 3m L min 的加料速率通过 017mm 口径的喷嘴进行喷雾干燥 , 入口和出口温度分别为 40和 50 , 进风量为 450N L h (N L h :20 、 1个大 气压的标准状况下的风量单位 , 即标准升每小时 。 结

8、果 , 所得微球的粒径范围为 115m , 包封率 (质 量分数 为 46%; 由分子质量为 14kDa 、 末端开放 (uncapped 的 P LG A (P LA PG A :5050 或这种聚合物 与分子质量为 35kDa 、 末端开放的 P LG A (P LA PG A :5050 的混合物作载体所得微球具有较好的缓释功 效 , 可致血药浓度持续 14天维持在理想的 1g L 。Quaglia 等 2选择胰岛素和 P LG A 的醋酸溶液作为加料液 , 以 3m L min 的速率通过 015mm 口径的 喷嘴进行喷雾干燥 , 制备微球 , 进风量和入口温度分 别为 450N L

9、h 和 50 , 并且考察了处方中加入羟丙 基 22环糊精 (HP C D 对胰岛素释放的影响 。结果显 示 , 应用喷雾干燥技术能够有效地将胰岛素包裹在P LG A 微球中 ; 加入 HP C D 制得的微球其平均粒径为 1511m , 载药量 (质量分数 为 1127%, 大多呈规 则的球型 。 应用傅里叶变换红外光谱 (FTIR 观察微球内部胰岛素与 HP C D 之间的相互作用 , 发现胰岛素的二级结构发生了变化 , 胰岛素 2HP C D 复合物的 存在使胰岛素的释放速率减慢 3。11112 乳剂 喷雾干燥法 (Emulsion S pray 2drying 该方法与溶液 喷雾干燥法

10、的不同之处在于加料液 为乳剂 , 通常的制备过程为 , 将蛋白 、 多肽类药物溶 于少量水中 ,P LA 或 P LG A 溶于二氯甲烷中 , 再将药 物溶液缓缓滴入共聚物溶液中 , 搅拌匀化成乳化液 ,通过喷嘴喷雾干燥即得药物微球 。G avini 等 4采用该法制备了肽类药物万古霉素 的 P LG A 微球 , 用于眼部给药 。他们首先将万古霉 素溶于 10m L 蒸馏水中 ,P LG A 溶于 290m L 二氯甲 烷中 , 5分钟内 (100005 , 随后将所得 W O 10L 的加料速率通过口径为 017mm , 入口和出口温度分别为 8085和 6870 。 最终得到的微球其药物

11、包封率接近于理 论值 (8412%9915% , 平均粒径约为 11m 。Quaglia 等 2 在应用溶液 喷雾干燥法的同时 , 也 考察了应用 W O 乳剂 喷雾干燥技术制备胰岛素的 P LG A 微球 。 其喷雾技术参数 :喷嘴口径为 015mm , 加料速率为 2m L min , 进风量为 500N L h , 入口温度 为 50 。 与溶液 喷雾干燥法相比 , 应用乳剂 喷雾干燥法制得的胰岛素 2HP C D 2P LG A 微球的平均粒径和载药量均有所降低 , 分别为 1211m 和 1111%, 微球多呈不规则形态 。处方中加入 HP C D 能够使总 体释放速率下降 , 胰岛

12、素持续释放达 45天 , 并且减小 了 突 释 。当 加 入 表 面 活 性 剂 如 吐 温 20或 P oloxamer 188时 , 可导致微球具很高的突释率 (49%54% , 并且释放速率加快 , 而仅含胰岛素的处方 则具有较低的突释率 。Lane 等 5采用生物可降解聚合物 P LG A 作载体 材料 , 实现了人血清白蛋白 (HS A 的微囊化 , 并比较了两种不同的制备方法 :W O W 乳化 冷冻干燥法 和 W O W 乳化 喷雾干燥法 。 其中后者喷雾干燥技 术参数 :入口和出口温度分别为 78或 79和 50 , 进风量为 600N L h 。结果 , 由这两种方法制得的微

13、 球中未释放和已释放的 H AS 其结构完整性相似 ; 应 用乳化 喷雾干燥法和乳化 冷冻干燥法制得的微球 平均粒径分别为 3146和 6165m , 载药量分别为 16189和 11164g , 包 封 率 分 别 为 84145%和 58120%。 由此可见 , 乳化 喷雾干燥法更佳 , 可以得到粒径小 、 载药量大及包封率高的微球 。 112 喷雾冷冻干燥法喷雾冷冻干燥法 (S pray Freeze Drying 是用于制 备蛋白 、 多肽类微球的一种新方法 , 即将溶解了蛋白 质的溶液通过一个气雾喷嘴喷于冷的蒸汽相中 , 蒸 汽相下面是低温液体层 , 小液滴通过蒸汽相的时候 2007

14、, Vol . 31, No . 7 299 Progress in Pharmaceutical Sciences 综述与专论 2007年第 31卷 第 7期 第 299 页 开始冻结 , 当接触到低温液体层时 , 小液滴完全冻结 , 将收集得到的冻结物置于冷冻干燥器中干燥 , 低温低压下使冰升华 , 得到干燥粉末 628。Maa 等 9首次提出应用喷雾冷冻干燥技术制备 蛋白质微球 , 并与喷雾干燥技术比较 , 以重组 -诱导 人免疫球蛋白单克隆抗体 (anti 2IgE M Ab 和重组人 脱氧核糖核酸酶 (rhDNase 作为模型药 。喷雾干燥 技术参数 :喷嘴口径为 015mm , 加

15、料速率为 15min , 进风量为 1050L h , 105和 5055 ; :径 、 加 料 速 率 和 始 温 度 为 -50 。 结果显示 315和 217m , 前者所得 微球表现出更好的空气动力学性质 , 且比表面积较 大 , 这是由于其多呈球形且疏松多孔粒子 , 其密度比 后者得到的微粒减小了 19。C ostantino 等 6考察了喷雾冷冻干燥中雾化条 件对牛血清白蛋白 (BS A 微球粒径和稳定性的影 响 。 结果显示 , 当喷雾流速增加时 ,BS A 易降解 ; 当 BS A 微球的粒径减小 , 也就是比表面积增大时 , 干燥后所得 BS A 的单体百分率降低 , 表明所

16、得微球比表 面积对 BS A 降解的影响很大 , 这可能是由于在喷雾 冷冻干燥过程中 BS A 与冰 -水界面接触时发生了变 性 ; 当金属 Zn 与 BS A 形成复合物时 , 会使微球比表 面积减小 , 但对粒径和蛋白质二级结构的影响不大 ; 另外 , 粒径的减小也有助于 BS A 突释率的降低 。C ostantin o 等 7还考察了不同处方因素对喷雾冷 冻干燥制得的 BS A 微球粒径和稳定性的影响。 结果 显示 , 处方中加入低浓度的表面活性剂或者甘露醇会 在一定程度上增加 BS A 的稳定性 , 且对粒径无影响 ; 加入海藻糖也可成功提高 BS A 的稳定性 , 但会使粒径 显著

17、增大 ; 当不使用增加稳定性的辅料时 , 喷雾过程 的雾化条件会导致 BS A 单体损失约 10%。 113 喷雾液中冷冻法 在喷雾冷冻干燥过程中 , 与冷冻和干燥相关的 应力可能对蛋白质造成不可逆的破坏 , 如结构降解 、聚集及再水化引起的酶活性损失 。 Webb 等 8已通过实验证明 , 由雾化引起重组人干扰素 (rhIFN 2 在气 -液表面的吸附会导致其显著降解 。近年来出现的喷雾液中冷冻技术 (S pray Freezing Into Liquid 则是将蛋白质溶液通过一个绝缘的喷嘴直接喷射到液氮中 , 而不像喷雾冷冻干燥那样将溶液喷射到冷的蒸汽相中 , 这是喷雾液中冷冻技术的 主要

18、标志 。已有人采用该技术制备了胰岛素 、 BS A和一些水不溶性药物纳米粒 10216, 其中制得的胰岛 素微球其堆密度小 , , 粒度分布窄 , 且微 %0125%, 表明胰岛15; 所得 BS A 微球中蛋白质单14。 在制备重组溶菌酶微球中 , 与喷雾冷冻干燥法相 比 , 喷雾液中冷冻法制得的蛋白质微球更小 , 酶活性 损失更小。 这主要缘于喷雾步骤的不同 , 因为该法在 雾化过程中粒子暴露于空气 -水界面的时间短 , 所以 蛋白质聚集、 变性的机会减少 , 所得粒子的稳定性更 好 17。 114 低温喷雾提取法Cleland 等 18以可降解聚合物为载体材料 , 采用 一种创新的低温过

19、程 低温喷雾提取技术 (Cry o 2genic S pray Extraction , 制备了重组人生长激素微球 (rhGH , 即将 Zn 2rhGH 复合物混悬于溶解了 P LG A 的二氯甲烷溶液中 , 通过一个超声喷嘴雾化后 , 喷射 到液氮和冻结的乙醇中 , 液氮蒸发时释放出的热量 使乙醇溶解 , 并将二氯甲烷从微球中提取出来 , 最后 将处理后的微球进行过滤 、 干燥即可 (见图 1 。这 个过程的优点在于 , 包载过程中避免了蛋白质接触 到水 , 这样也就避免了经常发生在有机相 -水界面 的蛋白质变性 ; 且若在处方中加质量分数为 1%的 固体碳酸锌 (粒径小于 5m , 能减

20、少 rhGH 从微球 中突释 。目前应用该方法成功开发出的 rhGH 微 球 , 已以商品名 Nutropin Depot T M上市 。图 1 低温喷雾提取法制备 rhGH 微球的工艺示意图(Fig 11Process for producing rhG H 2containing P LG A microspheres by cry ogenic spray extraction 综述与专论 2007年第 31卷 第 7期 第 300 页 300 2007, Vol . 31, No . 7 Progress in Pharmaceutical Sciences 近来 , 这种低温无水的微

21、球制备工艺已被报道用于制备重组人胰岛素样生长激素 (rhIG F 2I 19、 血管内皮生长因子 (rhVEG F 18、 神经生长因子 (rhNG F 20以及干扰素 22b (IFN 22b 21的控释制剂。 2 壳聚糖类已有相关文献证明壳聚糖是一种生物相容性好 、 毒性低 、 可生物降解的多糖 , 着剂 , 皮细胞 22,23。 至今 , 出壳聚糖微球 , :。G renha 等 24三聚磷酸盐纳米粒能 够有效改善黏膜表面对肽类的吸收 , 他们将典型的干 粉吸入剂辅料甘露醇和乳糖溶于水后 , 加入到载有蛋 白质的壳聚糖纳米粒混悬液中 , 以 215m L min 的加料 速率通过 017

22、mm 口径的喷嘴进行喷雾干燥 , 以甘露 醇和乳糖为辅料的入口温度分别为 160和 135 , 出 口温度分别为 108和 85 , 进风量分别为 400和 320N L h 。 结果 , 得到的微球大多数为球形 , 直径在 119410m 之间 , 具有适合于肺部给药的空气动力学性质 , 其形态受壳聚糖纳米粒用量的影响很大 ; 这些纳 米粒表现出很好的蛋白载药量 (65%80% , 并能在 15分钟内释放 75%80%的胰岛素。多肽、 蛋白质类口服给药的关键是要保证其在胃 肠道及其他吸收部位不被酸性介质和酶降解。 为此 ,C oppi 等 25,26用喷雾干燥法制备了一个以藻酸盐和壳 聚糖为

23、载体、 BS A 为模型药的微粒系统 , 即将 BS A 溶 于 20mg L 海藻酸钠溶液中 , 以 5m L min 的加料速率 通过 015mm 口径的喷嘴进行喷雾干燥 , 入口和出口 温度分别为 140和 6065 , 进风量为 600N L h , 制 得的微粒首先置于海藻酸钠 -氯化钙 (1 5 溶液中 , 然后放入海藻酸钠 -壳聚糖 (1 014 溶液中 , 使微粒 硬化以抵御胃肠道的降解 , 最后进行交联即可 。结 果显示 , 最终所得微粒在模拟胃肠道环境下稳定 ; 可 靶向作用于 Peyer s patches (派尔集合淋巴结 ; 系统 pH 值低于蛋白质等电点 (pI 时

24、载药量要高于 pH 与 pI 接近时载药量 , 这是由于蛋白质和聚阴离子藻酸 盐之间的静电作用所致 ; 蛋白质在模拟胃肠液中的 释放分 3个阶段 , 且不受介质种类的影响 。采用喷雾干燥及交联剂处理的方法可制备出粒径小、 形态好的壳聚糖微球 , 但是所用交联剂通常存在毒性 , 导致了交联壳聚糖微球在药学领域的应用受 到一定的限制。 Oliveira 等27将壳聚糖溶于 7mg L醋酸溶液中 , 以 6m L min 的加料速率通过 017mm 口 径的喷嘴进行喷雾干燥 , 500600N L h , 入 和 8590 , 制得的 无毒的 d , l 2甘油醛进 , 得 微 球 形 态 好 ,

25、平 均 粒 径 约 为, 粒度分布窄 , 可用于控释给药 ; 且发现增大d , l 2甘油醛浓度和延长交联时间均会使壳聚糖微球的膨胀率和 zeta 电位下降。 3 结 语喷雾干燥工艺制备微球是一个物理过程 , 参数易 控 , 操作简单 , 节省时间 , 且条件温和 , 适用于蛋白、 多 肽等不稳定药物的微囊化。 因此 , 与传统技术相比 , 喷雾干燥技术用于制备蛋白类微球具有明显优势。但是基于蛋白 、 多肽类物质的性质 , 喷雾干燥过 程中的一些因素 , 如喷嘴的剪切力 、 液滴干燥时产生 的热应力 、 蛋白或多肽在空气 -液体界面的吸附等 都会对这些生物大分子造成一定的破坏 。 相信随着 越

26、来越多的蛋白 、 多肽类药物微球的开发 , 这项技术 一定会愈加完善 。参考文献 1 Blanco 2Pryeto M J , Campanero M A , Besseghir K, et al.Importance of single or blended polymer types for controlled in vitro release and plasma levels of a s omatostatin analogue entrapped in P LA P LG A microspheres J.J Controlled Re 2lease , 2004, 96(3 :

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