质粒构建课件ppt课件

1、 质粒构建质粒构建11孟庆明孟庆明2019-04-09主要内容主要内容v质粒的概念及特点质粒的概念及特点v质粒构建的基本步骤和原理质粒构建的基本步骤和原理一、质粒的概念一、质粒的概念载体载体vector;carrier;vehicle） 可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。基因工程中广泛应用的载体多独立和稳定的自我复制的核酸分子。基因工程中广泛应用的载体多来自人工改造的细菌质粒、噬菌体或病毒核酸等。多数载体是来自人工改造的细菌质粒、噬菌体或病毒核酸等。多数载体是DNA分子，但某些分子

2、，但某些RNA分子也能用做载体。分子也能用做载体。质粒质粒plasmid） 独立于染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细独立于染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌中染色体以外的双链、闭环胞器和细菌中染色体以外的双链、闭环DNA分子。现在习惯上用来分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。分为紧密控制型因工程中质粒常被用做基因的载体。分为紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型和松驰控制型(Relaxed cont

3、rol) 4在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，不影响受体细胞正常生命活动；有多个限制酶切点MCS），而且每种酶的切点最好只有一个，可适于多种限制酶切割的DNA插入；含有复制起始位点，能够独立复制；有一定的标记基因，便于进行筛选。如pEGFP-n1质粒携带卡那霉素抗性基因，pcs2质粒携带氨苄青霉素抗性基因；载体DNA分子大小应合适，分子量小1-10KD）、多拷贝、松驰控制型，便于操作及大量扩增，如我们实验室常用的 pcDNA3.1,pcs2-6myc, pEGFP-n1等。二、质粒的特点二、质粒的特点55三、质粒图谱阅读三、质粒图谱阅读 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型原核/真核/

4、穿梭质粒）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。Ampr 氨苄抗性；kanr 卡那霉素抗性。neor 使G418失活。 第三步：看多克隆位点MCS）。是否具有多个限制酶的单一切点。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。 五步阅读质粒图谱五步阅读质粒图谱四、质粒构建的基本步骤和原理四、质粒构建的基本步骤和原理 背景介绍：背景介绍： 重组重组DNA技术技术recombinant DNA technology是基因功能研究的基本方

5、法。应用是基因功能研究的基本方法。应用该技术可以对该技术可以对DNA分子进行剪切和重新连接，构分子进行剪切和重新连接，构成重组成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物。克隆片段，表达相关基因的产物。克隆clone是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。构建的子代群体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆的分子克隆molecular cloning过程。因此，重组过程。因此，重组DNA技术又称为基因技术又称

6、为基因克隆技术或基因工程技术。克隆技术或基因工程技术。基因克隆Gene cloning （以hBex2为例）vTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer designvAmplification, digestion & ligationvTransformation & IdentificationTarget geneTarget geneTarget geneTarget geneGene cloningvTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer designvAmplification, digest

7、ion & ligationvTransformation & IdentificationVectors with fluorescent tag:pEGFPC1;pEGFPN1;pEYFP;pSUPER;pCS2(GFP)Vectors with non-fluorescent tag:pKH3(3HA);pCS2(6myc);pcDNA3.1(flag);pCMV5(flag);pGEX (GST);VECTORS/vectordb/ Gene cloningvTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer de

8、signvAmplification, digestion & ligationvTransformation & IdentificationPrimer designPrimer designSense: 5 ATGGAGTCCAAAGAGGAACG 3Primer designAntisense 5 TCAGGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3Primer designSense: 5 ATGGAGTCCAAAGAGGAACG 3(Forword) Antisense 5 TCAGGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3(Reverse)?Primer designvBe

9、fore order itv Think about what should be included in linker:Restriction site selectionProtective oligonucleotides for effective cleavageKozak translation initiation site (GCC GCC A/GCC ATG G)Open reading frames (for fusion protein)Stop codon?InsertS? REREORF?K?Search for restriction sitesSearch for

10、 restriction sitesProtective oligonucleotides for effective cleavageCleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)CGGAATTCCGGGATCCEcoR IBamH Ineb/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_olignucleotides.asp Kozak translation initiation sitevInitiation of translation in euk

11、aryotes.vConsensus sequence: GCC GCC A/GCC ATG Gv -3, 1, 2, 3, 4Open reading framesXX5 GA ATT CEcoR IBamH IG GAT CC 3 EGFPInsert (ATG XXX XXX )Product (fusion protein): Target protein + GFP EcoRI:GA ATT CTG HindIII:XXXOpen reading framesStop codonvTAGvTGAvTAANO AAntisense linker:AAG CTTBamHI:G GAT C

12、CAHindIII: AA GCT TEcoRI: G AAT TCBamHI: GGA TCCXXXSense linker:Open reading framesPrimer design: Stop codonAntisense 5GGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3Antisense 5 TCAGGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3Sense：hBex2/EcoR I 5-CG GAATTC ATGGAGTCCAAAGAGGAACG-3Antisense：hBex2/BamH I Antisense: 5 -CG GGATCCCG GGGCATAAGGCAAAAC

13、TCATCG-3Sense: 5-CG GAATTC ATGGAGTCCAAAGAGGAACG-35 -CG GGATCCCG GGGCATAAGGCAAAACTCATCG-3Gene cloningvTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer designvAmplification, digestion & ligationvTransformation & IdentificationAmplification (PCR):94C 394C 45 Tm 45 30-40 cycles72C 172C 10Template (cDNA or Pla

14、smid ) Sense primerAntisense primerDNA Polymerase(pfu) dNTP mixBufferddH2ODigestion & ligationPCR product or vectorEnzyme 1Enzyme 210XBuffer 100XBSA(?)ddH2O37C23 hPCR product VectorT4 DNA ligase10Xligase bufferddH2ORT 12 hor 16C O/NCTT CG GAT CCA CCGCGG TG AAT TCG AAGEcoR IBamH IGFPEcoR IBamH I5 G A

15、TC CGC5 A ATT CGCG 3insertG 3 5CGGA ATT CEcoR IBamH IGCG GAT CC 3insertG AAT TC 35 CG GG ATC CGCEcoR I/BamHI digestionCGG TGG ATC CCG XXXXX CAG AAT TCG AAGCTT CGA ATT CTG XXXXXCGG GAT CCA CCGGFPEcoR IBamH IEcoR I/BamHI digestionCTT CG GAT CCA CCGCGG TG AAT TCG AAGinsertG T4 DNA LigaseGFPGCGG ATC CGCA ATT CDigestion & ligationGene cloningvTarget gene: hBex2vVector se