紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性

1、收稿日期:2009-07-30;修订日期:2009-09-26基金项目:生物资源保护与利用湖北省重点试验(湖北民族学院开放基金项目;湖北省教育厅重点项目(D 20081010作者简介:紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性杨兰芳1,曾巧1,2,李海波1,闫静静1(1.湖北大学资源环境学院,湖北武汉430062;2.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,甘肃兰州730000摘要:土壤过氧化氢酶是土壤中非常重要酶类,为了探索一种测定土壤过氧化氢酶活性的简单、可靠而适用的测定方法,我们进行了利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性的方法研究。结果表明,紫外分光光度法重现性优于高锰酸钾容量法,溶液在240

2、nm 处的吸光度可以稳定11小时以上,对4种土壤分析表明,紫外分光光度法的测定结果与高锰酸钾容量法之间无显著差异。传统高锰酸钾容量法加酸后再过滤容易导致溶液有颜色,过滤液易浑浊,过滤时间长。本试验表明,在过滤前加入饱和铝钾矾,然后直接将溶液过滤到盛有酸的容器内,既可以使溶液无色,又能使溶液澄清透明,还能使过滤速度大为加快。总之紫外分光光度法重现性好、稳定时间长,操作简单,不需要特殊试剂,避免了容量法的滴定误差,是一种值得推广普及的测定土壤过氧化氢酶活性的好方法。关键词:紫外分光光度法;土壤;过氧化氢酶;容量法中图分类号:S 151.9文献标识码:A文章编号:0564-3945(201101-0

3、207-04土壤通报Ch inese Jo u r nal of So il S cienceVol.42,No.1Feb.,2011第42卷第1期2011年2月土壤酶活性是土壤生物活性和土壤生化反应强度反映1,也是土壤肥力水平的反映,土壤中的生化反应过程和养分形态的转化一般都是在土壤酶的参与下进行的。土壤酶主要来源于土壤微生物的活动和植物分泌物,土肥力水平2、土壤污染状况3,4以及土壤对环境变化的响应5都会影响土壤酶活性。通过分析土壤酶活性可以评价土壤土壤微生物活性、生物化学反应程度、土壤肥力水平和土壤污染状况。过氧化氢酶是生物呼吸、生物代谢过程,以及土壤动物、植物根系分泌及残体分解6,7中

4、的重要酶类,在生物体(包括土壤中,过氧化氢酶的作用在于破坏对生物体有毒的过氧化氢8。因此无论研究土壤、植物,还是动物过氧化氢酶都具有重要意义。一种快速、简便、准确测定过氧化氢酶活性的方法无疑对过氧化氢酶的研究具有促进作用。测定土壤过氧化氢酶活性主要是基于测定过氧化氢与酶作用后释放出的氧和测定剩余的过氧化氢两方面。利用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化氢酶活性的方法目前尚未见报道。本试验探索一种利用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化氢酶活性的方法,本方法的成功将有助于土壤过氧化氢酶分析和研究。1材料与方法1.1土壤材料试验所用土壤材料为红壤1、红壤2、山地黄壤和山地暗黄棕壤。红壤1和红壤2采自武汉市

5、鲁磨路南望山山脚的荒芜耕地,山地黄壤采自庐山三宝树附近,山地暗黄棕壤采自庐山博物馆旁边。土壤采回后在实验室内挑出根系等植物残体和岩石碎块,自然风干后过1mm 筛备用。所用土壤之基本理化性质如表1。1.2所用试剂与仪器(10.3%的H 2O 2:取30%的H 2O 2试剂稀释100倍即可,溶液准确浓度用高锰酸钾标定。(21.5m o l L -1硫酸:取42ml 浓硫酸,稀释后定容至500ml 。(3饱和铝钾矾:铝钾矾即明矾(K A l (S O 42·12H 2O 在20溶解度为10.84g,30的溶解度为15.41g.(40.01蚪虔m o l L -1高锰酸钾:称取3.16g 高

6、锰酸钾(K M n O 4溶解后定容至1L ,其准确浓度用标准草酸钠标定。(5紫外分光光度计:UV -9100,北京瑞利分析仪器有限公司。(6震荡器:Z D -8801回转振荡器,上海康华生化仪器制造厂。土壤So il红壤1红壤2黄壤黄棕壤有机质O r ganic ma tt e r碱解氮C E C (C m o l (+k g -1表1供试土壤基本理化性质Ta b le 1T h e b asic s o il p ro p e rty in e x p e r imen t第42卷土壤通报1.3方法(1测定原理过氧化氢酶能酶促过氧化氢分解生成水和氧气。通过加入定量过量的过氧化氢,与土壤作用

7、一段时间后,加入量与剩余量之差即为被酶催化反应消耗的过氧化氢,以此表示酶活性。过氧化氢(H2O2在240nm处有强烈吸收,通过测定与土壤反应后溶液在此波长下的吸光度,即可得到溶液中过氧化氢的浓度,从而可计算酶的活性。(2测定步骤称取土样2.00g于三角瓶,加入40ml蒸馏水,加入5ml0.3%的H2O2溶液,在震荡机上震荡20分钟。取下后迅速加入饱和铝钾矾1ml,立即过滤于盛有5ml1.5m o l L-1的硫酸溶液的三角瓶中。滤干后,将滤液直接在240nm处用1cm石英比色皿测定吸光度A s。同时做无土A0和无基质A k对照。称取土壤2.00g于100ml三角瓶中,加入40ml蒸馏水,加5m

8、l0.3%的H2O2溶液,振荡20分钟后加入1ml饱和铝钾矾,立即过滤于盛有5ml1.5M硫酸的三角瓶中,滤干后,吸取滤液25ml,用0.01蚪虔m o l L-1的高锰酸钾溶液滴定至紫色,同时做无土对照。与高锰酸钾容量法的结果相比较,都统一用每20分钟内每克土壤分解的过氧化氢的毫克数表示酶活性。(1紫外分光光度法酶活性的计算E=A e×T,A e=A0-A s+A k,T=CV0×51×17。E是土壤过氧化氢酶活性,W为土样重量,T是单位吸光度相当于过氧化氢的毫克数,A0是无土对照即空白溶液的吸光度,A s是样品溶液的吸光度,A k是无基质对照溶液的吸光度,C是

9、高锰酸钾的浓度,V是吸取V0ml 的无土对照即空白溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高锰酸钾溶液的体积。(2高锰酸钾容量法酶活性的计算:E=(V-V sC×51V0×17W。V是V0体积空白溶液所消耗的高锰酸钾体积,V s是V0体积样品溶液所消耗的高锰酸钾体积,C是高锰酸钾的浓度,W是土壤重量。2.51,阳离子交换量(C E C用醋酸铵法9。2结果分析2.1方法的重现性用红壤1做样品,称取20份土样,每份2.00g,其中10份用作加基质的反应,10分用作无基质对照,同时做一份空白对照即无土对照。按测定方法处理测定溶液吸光度后,吸取25ml用高锰酸钾溶滴定,分别计算两种方法的酶活性。

10、由表2可见,紫外分光光度法测定的土壤过氧化氢酶活性与高锰酸钾容量法测定土壤过氧化氢酶活性的平均值非常接近,t检验表明,两种方法测定结果之间无显著差异(P=0.663。10次重复的重现性来看,高锰酸钾容量法的标准差和变异系数大于紫外分光光度法。说明紫外分光光度法的重现性优于高锰酸钾容量法。2.2稳定性将红壤1称取10份,每份2.00g,其中5份加过氧化氢,5份不加过氧化氢用作无基质对照。按操作步骤测定吸光度,然后分别在放置2、3、4、11小时后测定吸光度。表3可见,放置时间对吸光度影响很小,无论是有基质的样品,还是无基质的对照,各放置时间之间无显著差异,说明在酸性条件下,过氧化氢很稳定,放置11

11、h后吸光度无显著变化。2.3硫酸加入方式的影响用红壤2称取20份,每份2.00g,进行4种处理,每处理重复5次,即加过氧化氢振荡后加酸5ml立即过滤、加过氧化氢振荡后直接过滤到盛有5ml硫酸的三角瓶中、无基质对照加酸后过滤和无基质对照直接过滤到盛有5ml酸的三角瓶中。表4表明,硫酸加入顺序对溶液吸光度有显著影响。在加酸后过滤的条件方法M e tho d紫外光度法钾容量法重复次数T h e num b e rof r e p ea t1010酶活性均值M ean ofen z y me ac t i v i ty5.195.36标准差St anda r d e rror0.200.27变异系数C

12、 V3.855.04表2两种方法测定的红壤过氧化氢酶活性(mg H2O2g-1Ta b le2C a t alase ac t i v i ty in r ed s o il measu r ed b y t w o me tho ds处理T r ea t men t有基质无基质0.672±0.0030.104±0.00520.672±0.0040.103±0.00330.666±0.0060.101±0.00540.669±0.0070.104±0.004110.676±0.0060.108±

13、0.005放置时间Time表3不同放置时间(h下的吸光度Ta b le3T h e a b s or b enc y in v a r i o us p lacing t ime2081期下,加过氧化氢样品的吸光度已经超出了仪器的读数范围,无法测得吸光度,无基质对照的吸光度也在1以上,这就不能测得土壤过氧化氢酶的活性。这种方法得到的溶液有颜色,即使用容量法测定也影响终点判定,在有机质含量高的条件根本就无法滴定。在直接过滤到盛有酸的三角瓶中的条件下,不管是加过氧化氢的样品,还是无基质对照,其吸光度均在正常范围,由此得出的土壤过氧化氢酶活性与用高锰酸钾容量法测得的酶活性之间无显著差异。2.4铝钾矾

14、的影响取红壤2称取30份,每份2.00g。设置6个处理,即加过氧化氢的样品和不加过氧化氢的无基质对照。按振荡前加、振荡后加1ml饱和铝钾矾和不加铝钾矾,每处理重复5次。表5可见,铝钾矾的加入与否以及加入方式对溶液吸光度有显著影响。无论是有基质的样品还是无基质对照,不加铝钾矾时,过滤速度慢,且溶液浑浊,所以不加铝钾矾的溶液吸光度显著高于加铝钾矾的吸光度。铝钾矾的加入顺序对有基质样品的吸光度有显著影响,振荡前加铝钾矾的吸光度大于振荡后加铝钾矾的吸光度。无基质对照的吸光度不受铝钾矾加入顺序的影响,振荡前加和振荡后加二者的吸光度无显著差异。2.5不同土壤上的运用取红壤1、红壤2、山地黄壤和山地暗黄棕壤

15、分别运用紫外分光光度法和高锰酸钾容量法测定过氧化氢酶活性,每种土壤均重复5次,结果见表6。由表6可见,4种土壤的过氧化氢酶活性的紫外分光光度法测定结果与高锰酸钾容量法测定结果之间无显著差异,说明紫外分光光度法可以运用于土壤过氧化氢酶活性的测定。3讨论土壤过氧化氢酶的测定方法主要有高锰酸钾容量法1012、气量法11,13、纸片法11、气相色谱法14,15等。高锰酸钾容量法虽然简单,但是滴定过程人为误差大,操作比较费时。气量法需要特殊装置,操作麻烦,不便于批量样品分析,纸片只能做为定性,定量误差太大,而气相色谱法需要特殊的仪器,仪器设备昂贵,操作调试复杂,不利于普及。T r asa r-C e p

16、 eda等16提出了一种可见分光光度法,其原理是基于土壤与定量的过氧化氢作用一定时间后,剩余的过氧化氢在过氧化物酶作用下产生氧气,可以氧化4-氨基安替比邻与苯酚形成一种有色物质在505nm处有强吸收,但是该法操作也比较繁琐,同时需要过氧化物酶,不仅不好购买,其价格也不便宜,分析成本高。探索一种简单适合于批量分析而又便于普及的方法对于土壤过氧化氢酶的研究具有重要实践价值。本试验证明,利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性具有重现性好、稳定、操作简单、适宜于批量分析、仪器设备不昂贵等多方面优点,是一种值得推广普及的方法。本试验发现,利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性中,必须在振荡后将溶液过

17、滤到盛有硫酸的器皿中,而不能按传统容量法那样加酸后再过滤。因为加酸后再过滤,会使土壤中酸溶性有机物质溶解到溶液中来,使过滤后的溶液产生颜色,从而影响吸光度。其实对于有机含量较高的土壤,就是用容量法,也会因溶液颜色太深而在滴定中无法判断终点得不出结果。加酸的作用主要是终止酶与过氧化氢的反应,同时在容量法中,用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢时,必须在酸性条件下才能进行反应。本试验证明用紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性时,不能在过滤前加酸,所以采用将溶液过滤到盛有酸容器中,这样做就有可能延长酶与基质的作用时间,从而使结果偏高。为了缩短过滤时间,则加入饱和铝钾矾溶液。本试验表明,加铝钾矾溶液后过滤,不仅使

18、过滤速度大为加杨兰芳等:紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性处理T r ea t men t 有基质无基质加酸后过滤F il t e r ing a ft e r acid addi t i o n读数溢出1.139±0.101过滤于盛有酸容器中F il t e r ing in to acid0.774±0.0050.115±0.004吸光度A b s or b enc y表4硫酸加入顺序对吸光度的影响Ta b le4T h e addi t i o n sequence of sul f a t e acid处理T r ea t men t 有基质无基质不加铝

19、钾矾N o alum1.105±0.1700.532±0.064振荡后加铝钾矾A dding alum a ft e ro scilla t i o n0.624±0.0120.108±0.001吸光度A b s or b enc y表5饱和铝钾矾对溶液吸光度的影响Ta b le5T h e e ff ec t of alum s o lu t i o n o n s or b s t enc y振荡前加铝钾矾A dding alum b e for eo scilla t i o n0.741±0.0060.107±0.005土壤S

20、o il1红壤1红壤2黄壤黄棕壤紫外光度法U l tr a v i o le ts p ec tro p hoto me try5.08±0.195.84±0.074.86±0.299.20±0.40容量法V o lume tr icme tho d5.34±0.255.83±0.054.69±0.219.20±0.78T检验P值V alue ofP in t-t es t0.0980.2010.3220.986酶活性(mg H2O2g-1(20min-1表6不同土壤过氧化氢酶活性的测定Ta b le6D e t

21、e r mining th e ac t i v i ty of ca t alase in di ff e r en t s o il209第42卷土壤通报Measurement of Catalase Activity in Soil by UltravioletSpectrophotometryY A NG L an-f ang 1,Z E NG Q ia o 1,2,L I H ai-b o 1,Y A N J ing-jing 1(1.School of Resource and Environmental Science,Hubei University,Wuhan 430062,

22、China;2.Cold and Arid Regions Environmental andEngineering Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China .Abstract:C a t alase is an im p ort an t en z y me in s o il.I n or de r to f ind a sim p le,r elia b le and a pp lica b le me tho d to measu r e th e ac t i v i ty of s o

23、il ca t alase,th e e x p e r imen t to de t e r mine th e ca t alase ac t i v i ty in s o il b y ul tr a v i o le t s p ec tro p hoto me try w as c o nduc t ed.T h e r esul t s s ho w ed th a t th e r e p ro duci b ili ty of ul tr a v i o le t s p ec tro p hoto me try w as b e tt e r th an p ot assi

24、um p e r mangana t e v o lume tr ic me tho d.T h e a b s or b enc y of s o lu t i o n of s o il e x tr ac t in 240nm h ad n o v isi b le c h anges a ft e r s tor ed 11h .T h e r esul t s fro m 4s o ils indica t ed th a t th e r e w as n o signi f ican t di ff e r ence b e t w een ul tr a v i o le t

25、s p ec tro p hoto me try and p ot assium p e r mangana t e v o lume tr ic me tho d.T h e addi t i o n of sul f a t e acid b e for e f il tr a t i o n in tr adi t i o nal v o lume tr ic me tho d led to a c o l or ed and t u r b id s o lu t i o n,and l o ng f il tr a t i o n t ime.T h e c o l or and t

26、 u r b idi ty in s o il e x tr ac t w as disad v an t age to measu r e th e a b s or b enc y .A dding alum sa t u r a t ed s o lu t i o n b e for e f il tr a t i o n and th en f il tr a t ing in a u t ensil w i th 5ml sul f a t e acid (1.5m o l L -1c o uld gain a c o l or less and tr ans p a r en t

27、s o il e x tr ac t and s hort en th e f il tr a t ing t ime.I n c o nclusi o n,w i th h ig h r e p ro duci b ili ty and s t a b ili ty ,sim p le o p e r a t i o n,n o s p ecial r eagen t and a v o idance of th e e rror in t i tr ime try ,ul tr a v i o le t s p ec tro p hoto me try w as a v alua b le

28、 me tho d and w orth of p o p ula r i z a t i o n in de t e r mina t i o n of s o il ca t alase ac t i v i ty .Key words:Ultraviolet spectrophotometry;Soil;Catalase;Volumetric method快,而且也使溶液清亮透明,不加铝钾矾的处理过滤速度不仅慢,过滤的溶液也浑浊,从而产生很大的吸光度。由于振荡前加铝钾矾的吸光度显著高于振荡后加铝钾矾的吸光度,说明铝钾矾对过氧化氢酶具有一定的抑制作用,因此振荡后过滤前加入饱和铝钾矾不仅可以

29、加快过滤速度,使溶液清澈透明,而且还可以抑制酶与基质的反应,减少过滤时间带来的误差。总之,紫外分光光度法是一种操作简单,重现性、稳定性均好,而且不需要特殊试剂的测定土壤过氧化氢酶活性方法。4结论(1同一土壤10次重复测定的结果表明,紫外分光光度法的变异系数小于高锰酸钾容量法,说明紫外分光光度法重现性优于容量法。(2溶液放置11小时后,吸光度依然没有显著变化,说明紫外分光光度法稳定性好。(3利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性时,不能象传统方法那样加酸后再过滤,而应该直接将溶液过滤到盛有硫酸溶液的器皿中。(4利用紫外分光光度测定土壤过氧化氢酶活性应该在振荡后过滤前加入饱和铝钾矾溶液,这样既可

30、加快过滤速度,又能得到澄清透明的溶液,便于测定吸光度和减小误差。(5利用4种土壤的测定结果表明,紫外分光光度法的测定结果与高锰酸钾容量法无显著差异,紫外分光光度法是一种值得推广普及的测定土壤过氧化氢酶活性的方法。参考文献:1M E R S I W ,SC H INN E R F .A n im p ro v ed an d accu r a t e me tho d forde t e r mining th e de hy d ro genase ac t i v i ty of s o ils w i th i o d o ni trot e tr a-z o lium c h l or

31、ide J.Bi o l.and F e rt .of So ils.1991,11:216-220.2王娟,谷雪景,赵吉.羊草草原土壤酶活性对土壤肥力的指示作用J.农业环境科学学报,2006,25(4:934-938.3T R ASA R -C E P E DA C ,L E I R 譫S M C ,S E O A N E S ,e t al.L imi t a t i o ns of s o il en z y mes as indica tor s of s o il p o llu t i o n J.So il.Bi o 1.an d Bi o c h em.,2000,32:186

32、7-1875.4BE M T I E Z E,M E L G A R R ,M E L G A R H ,e t al.En z y me ac t i v i t ies in th e rh i z o s p h e r e of p o pp e r (C a p sicum annuum L .g ro w n w i th o li v e ca k e mulc h es J.So il B o il.and Bi o c h em.,2000,32:1829-1835.5孙辉,吴秀臣,琴纪红,等.川西亚高山森林土壤过氧化氢酶活性对升高温度和C O 2浓度的响应J.土壤通报,2007,387(5:891-895.6A NN A K B,R I C H A R D P D .F ield managemen t e f ec t s o n s o il en z y meac t i v i t ies J.So il Bi o 1and Bi o