维甲酸对胰腺癌细胞生长的抑制作用及其机制研究

1、    维甲酸对胰腺癌细胞生长的抑制作用 及其机制研究        摘要目的：观察两种维甲酸(RA)对人胰腺癌细胞生长的抑制作用及其可能机制。方法：应用MTT比色法、流式细胞仪、裸鼠肾包膜下移植瘤抑制试验和透射电镜技术进行检测。结果：RA抑制胰腺癌细胞生长，6 d组抑制50%细胞生长的药物浓度(IC50)全反式RA(ATRA)和13-顺式(CRA)分别为1030 mol/L 和3050 mol/L。癌细胞在RA作用下，G0G1期细胞比例增加，S期细胞比例和增殖指数

2、(PI)下降。ATRA 6 d组凋亡指数(AI)增高，ATRA和CRA 6 d组AI/PI比例分别是对照组的4倍和2倍。ATRA能显著抑制肾包膜下胰腺癌移植瘤生长，电镜检查证实部分胰腺癌细胞具有凋亡特征。结论：RA抗胰腺癌细胞生长作用主要与抑制细胞增殖有关。主题词胰腺肿瘤；维生素A酸类；细胞系 The mechanisms of inhibitory effect of retinoic acidon human pancreatic carcinoma cellsCHEN Qi-Kui, YUAN Shi-Zhen, ZENG Zhi-Yong, HUANG Zhi-QingDepartme

3、nt of Internal Medicine, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Guangzhou (510120)Abstract AIM:To investigate the mechanisms of two kinds of retinoic acid (RA) on the growth inhibition of human pancreatic carcinoma cells. METHODS：MTT colorimetric assays, flow cytometric analysis, subrenal capsule(SRC) xenog

4、raft assay in nude mice and transmission electron microscopy were performed. RESULTS：RA inhibited the growth of pancreatic caricinoma cells. The 50% inhibitory concentration (IC50) of all-trans RA(ATRA) and 13-cis RA(CRA) on cell growth occurred after 6d induction were 1030 mol/L and 3050 mol/L resp

5、ectively. RA increased the precentage of cell population in the G0/G1 phase ,but reduced it in S phase and also reduced proliferation index (PI). Cell apoptosis index (AI) was higher in 6d ATRA treated group than control group. AI/PI of ATRA and CRA 6d treated group were 4 and 2 times as control gro

6、up. ATRA inhibited significantly growth of SRC pancreatic carcinoma. The morphology of ATRA treated cells was primarily characterized by apoptosis. CONCLUSION：The antitumor effects of RA are primarily related to the inhibition of proliferation of pancreatic carcinoma cells.MeSHPancreatic neoplasms;

7、Retinoids; Cell line维甲维(retinoic acid, RA)具有防癌、抗癌作用，已广泛应用于某些癌肿的临床预防和治疗1。鉴于国内外尚未开展RA抗人胰腺癌作用的报道，本研究应用经典的细胞分化诱导剂全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)和13-顺式维甲酸(13-cis retinoic acid, CRA)，体外、体内诱导胰腺癌细胞，初步观察其对细胞生长、增殖、分化和凋亡的影响，探讨RA的抗胰腺癌作用及其可能机制，为胰腺癌防治探索新途径。材料与方法1.细胞和动物：人胰腺癌细胞株SW1990，由美国加州大学引进，BALB/c纯系裸小鼠(SP

8、F级)由本校实验动物中心提供。2.主要药品及试剂：ATRA和CRA购于Sigma公司，制备10 mmol/L原液贮存备用。Eagle's培养基(Eagle's MEM)，细胞凋亡检测试剂盒、噻唑蓝(thiazoll blue, MTT)和碘化丙啶分别由GIBCO、Boehringer Mannheim、 Sigma公司提供。3.细胞生长抑制作用的检测采用MTT法：EL312e酶标仪(BIO-TEK公司)检测并打印吸光度A595，每组设5个重复孔，计算细胞活力。IC50表示抑制50%细胞生长的药物浓度。4.细胞周期动力学检测采用碘化丙啶一步染色法；ELITE流式细胞仪(Coult

9、er公司)检测DNA含量，激发波长488 nm,发射波长620 nm。MUTICYCLE软件(PHOENIX公司)分析细胞周期分布，增殖指数(proliferation index, PI)为S、G2+M期细胞占所测定细胞总数的百分比。5.细胞凋亡的检测采用末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法：培养细胞后经新鲜配制的4%多聚甲醛固定30 min，含0.2% Triton-X-100的0.1%柠檬酸钠4渗透5 min，300目尼龙网过滤。沉淀加入50 L的TUNEL反应混合液，以50 L标记液(不含酶)做阴性对照。37湿化、避光振荡7

10、5 min。PBS洗涤标记细胞2次，250 L PBS悬浮细胞，进行流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长525 nm。凋亡指数(apoptosis index, AI)为凋亡细胞所占测定细胞总数的百分率，AI/PI为凋亡与增殖细胞的比例。6.裸鼠肾包膜下(subrenal capsule, SRC)移植瘤抑制实验：雄性BALB/c裸鼠18只，每只体重2030 g，随机分为4组，每组45只。分别麻醉，开腹，暴露肾脏，用胸骨穿刺针将皮下传代的SW1990胰腺癌移植瘤(每块约1 mm3)植入双肾包膜下。RA组于接种48 h后按隔日腹腔注射40 mg/kg ATRA或CRA，对照组给等量生理

11、盐水或RA溶剂共4次。分别于接种时和停药48 h后称体重(body weight, BW)，解剖显微镜测量肿瘤长短径。移植瘤大小(tumor size, Ts)按文献报道的方法计算，即Ts=1/2×长径×短径2结果1.RA对胰腺癌细胞生长的抑制作用：RA能有效抑制体外培养的SW1990细胞生长，ATRA的抑制作用具有时间与浓度依赖性。1 d、3 d和6 d ATRA IC50分别为50 mol/L、 3050 mol/L和1030 mol/L； CRA IC50分别为50 mol/L、 3050 mol/L和3050 mol/L(1)。   &

12、#160; Fig 1 Effect of ATRA(A) and CRA(B) on cell activity of SW1990 cells(n=5)1ATRA(A)和CRA(B)对SW1990细胞活力的影响2.RA对胰腺癌细胞周期和AI的影响：RA(30 mol/L)处理3 d和6 d组SW1990细胞的G0/G1期细胞比例上升，S期细胞比例下降，PI逐渐降低。ATRA(30 mol/L)能诱导6 d组SW1990细胞凋亡。ATRA和CRA组AI/PI比率增高，分别是对照组的4倍和2倍(表1)。表1RA对SW1990细胞周期及AI的影响GroupnG0/G1(%)S(%)PI(%)AI

13、(%)AI/PIControl641.8±4.146.4±2.058.2±4.23.3±2.20.06±0.04ATRA 3d356.7±0.8*22.8±1.1*43.9±0.8*4.4±1.70.10±0.04ATRA 6d360.9±1.5*33.4±1.6*39.1±1.6*9.6±1.9*0.24±0.05*CRA 3d349.2±0.3*33.3±0.4*50.8±0.3*3.8±1.40.07

14、±0.03CRA 6d356.8±5.2*41.9±4.143.6±4.7*5.2±1.00.12±0.02*     *P0.05, *P0.01, vs control3.RA对裸鼠SRC胰腺癌移植瘤的抑制作用：ATRA能显著抑制SRC胰腺癌移植瘤的生长，但ATRA和CRA对荷瘤裸鼠体重变化无影响(表2)。表2RA对裸鼠SRC胰腺癌移植瘤的影响GroupTs(mm3)BW(g)Normal saline control0.70±0.320.43±0.33(n=8)(n=4

15、)Solvent control0.69±0.26-1.00±0.94(n=10)(n=5)ATRA0.30±0.28*-1.10±2.10(n=10)(n=5)CRA0.52±0.20-0.75±0.96（n=8）(n=4)     *P0.01, vs normal saline control or solvent control4. RA 对胰腺癌移植瘤细胞形态学的影响：ATRA 组可见部分细胞出现凋亡特征，表现为细胞质与细胞核固缩，核间隙增宽，核裂解、起泡，细胞出芽和凋亡小体形成(2)

16、。Fig 2Transmission electron microscopy(TEM)observation of apoptosis in SRC pancreatic carcinoma xenograft after nude mouse was treated with 40 mg/kg ATRA,TEM×60002 40 mg/kg ATRA 治疗裸鼠后，SRC移植瘤的凋亡胰腺癌细胞讨论胰腺癌的预后极差，除极小比例的胰腺癌病人能早期诊断，进行根治性手术外，80%以上确诊的病人均属晚期。而晚期胰腺癌病人对化疗的耐受性差，目前应用最广泛的以5-Fu(5-氟尿嘧啶)为主的联合化疗

17、的方案只能使10%40%病人病情得以暂时缓解，中位生存期3.512个月2。因此，探索新的治疗方法对于延长胰腺癌病人生存期，改善胰腺癌病人生存质量有重大的应用价值。新近国内外已开始胰腺癌凋亡与分化诱导的实验性研究，eicosapentaenoic acid(EPA)诱导MIA PaCa细胞株的生长抑制与细胞周期阻滞和凋亡有关3。我们的系列研究也表明传统中药毒药三氧化二砷能诱导胰腺癌细胞周期阻滞与凋亡4。RA是维生素A的衍生物，具有防癌抗癌作用，是一种经典的细胞分化诱导剂1。我国学者率先将ATRA应用于急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)的临床

18、治疗，取得了令人注目的成就5，接着在胃癌的预防和肝癌细胞的分化诱导治疗方面也进行了有意义的探索6，7。本实验观察了RA对人胰腺癌SW1990细胞株的作用。增殖活跃的S期细胞比例下降，相对静止的G0/G1期细胞比例增高，PI下降，ATRA组凋亡细胞比例增加，裸鼠体内成瘤性的减低，以及细胞形态学上出现具有凋亡特征的细胞等证据表明RA的抗胰腺癌作用主要与抑制胰腺癌细胞增殖有关。另外，ATRA的效应还可能部分与诱导胰腺癌细胞凋亡有关。RA的作用和肿瘤细胞的类型有关，在一些细胞株诱导分化与凋亡，而另一些细胞株则与直接抑制有关1。RA的作用机制涉及分子、细胞和机体的各个方面，近几年尤以受体与基因调节的研究最为活跃。现已发现二大类RA特异性核内受体即维甲酸受体(RARs)和视黄醇受体(RXRs)，前者包括RAR、RAR和R