竹林土壤微生物总DNA提取方法研究

1、竹林土壤微生物总DNA提取方法研究摘 要： 本文使用细菌16srRNA基因的V3区引物对三种方法提取的DNA进行PCR-DGGE验证，实验结果表明：三种方法均能获得23Kb以上的DNA片段，但不同方法提取的DNA产量和质量存在明显差异。其中采用振荡、反复冻融、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠(SDS裂解细胞和酚氯仿抽提DNA法，结合异硫氢酸胍硅胶膜核酸纯化柱DNA纯化法能有效的去除土壤中腐植酸等杂质，是一种较理想的竹林土壤微生物总DNA的提取方法，可以为竹林土壤微生物群落分析提供可靠的分子生物学方法。Study on Extracting DNA from Bamboo SoilAbstract: T

2、hree methods for extracting total microbial DNA from environmental soil were compared. The DNA were amplified with 16SrRNA-based primers by use of the polymerase chain reaction, and the products of PCR then subjected to denature gradient gel electrophoresis (DGGE. The results showed that the three m

3、ethods all can get large DNA from Bamboo soil, but the effectiveness of them and the quality of DNA were different. The method described as lysing with shaking freezing thaw-proteinaseK-SDS could get the highest yield of soil microbial DNA, which was considered to be an effective method for extracti

4、ng DNA from Bamboo soil. The humid and other contamination can be removed by using of phenol-chloroformisoamyl alcohol (25:24:1 and isothioureas hydrogen acid guanidine, combining with the treatment of passing through Silica membrane purification columns. Finally, an effective method to obtain DNA f

5、rom Bamboo soil was established. Key words:Bamboo; Microbial; DNA extraction;PCRDGGE 我国竹类资源十分丰富，约占全世界1/3左右，在我国工农业生产和国民经济中占有重要地位1。竹林土壤微生物群落是竹林基本生态环境的一个重要组成部分，它们积极参与土壤物质转化过程，在土壤形成、肥力演变、植物养分有效化和土壤结构的形成与改良等方面起着重要作用2,3。竹林土壤微生物群落的结构和多样性也受到竹林其它生态因子的影响。土壤微生物群落的变化能够反映植物群落的生长环境的变化，从而为我们选择良好的竹林生长环境提供可靠的依据。因此，对

6、竹林土壤微生物进行深入研究具有重要意义。 利用传统的纯培养方法，人们曾对竹林微生物进行了研究，但近年来发展的免培养方法证明自然界中绝大部分微生物目前还不能纯培养4。因此，直接利用分子生物学手段对环境中微生物群落进行分析成为环境微生物研究的有效途径。目前，我国还未见应用免培养法研究竹林土壤微生物的报道。本文通过借鉴和改进其它环境微生物研究方法，成功地建立了一种适应于竹林土壤微生物总DNA提取的方法，为研究大规模的竹林土壤微生物分子生态学研究提供了可能。1 材料和方法1.1材料 供实验的土样于2006年4月取自浙江省临安市西径山。采样深度为05cm。按五点法采样，四分法混匀放入保鲜袋中，封口，带回

7、实验室，4保存。1.2竹林土壤DNA提取方法1.2.1 方法一 按参考文献5的报道的方法改动后进行，取1g土壤样品置于10mL离心管中，向其中加入5 mL土壤微生物总DNA抽提液(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA100mmol/L, Na3PO4 100mmol/L，NaCl 1.5 mol/L，1%CTAB，pH 8.0，再加入20L蛋白酶K(10 mg/mL和少许石英砂，于37摇床上以230 r/min震荡40 min，加入1.5 mL 10%SDS（pH7.2）于65水浴30min(每隔1015 min轻轻上下颠倒几次后， - 80冷冻20min，反复水浴、冷冻三次后于室温

8、6 000 r/min离心5 min，上清转移到另一10mL离心管中，向收集到的上清中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25241,体积比，混合均匀，室温10 000 r/min离心10 min，取上清加1/10体积65预热的NaCl/CTAB溶液（10%CTAB ,0.7mol/LNaCl）和等体积的氯仿-异戊醇再重复抽提2次，吸取水相于另一10 mL离心管中,再加入0 .6倍体积的异丙醇，4沉淀40 min，再在室温下以12 000 r/mim离心20 min收集核酸沉淀，用70 %乙醇洗涤2次，室温风干，用200L TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA

9、pH 8.0 ）溶解沉淀，4保存。1.2.2 方法二 取1g土壤样品置于10mL离心管中，向其中加入5 mL土壤微生物总DNA抽提液(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA100mmol/L, Na3PO4 100mmol/L，NaCl 1.5 mol/L，1%CTAB，pH 8.0，再加入20L蛋白酶K(10 mg/mL和0.5g石英砂，于37摇床上以230 r/min震荡40 min，加入1.5 mL 10%SDS（pH7.2），于65水浴2 h(每隔1015 min轻轻上下颠倒几次，于室温6 000 r/min离心5 min，上清转移到另一10mL离心管中，后面步骤与方法一相同。

10、1.2.3 方法三 细胞裂解过程与方法一相同。向细胞裂解后收集的上清中加入3倍体积的DNA联接液（6.5M/L GuSCN,50mmol/L Tris,PH6.0），于室温放置30min，10 000 r/min离心10 min，取上清。将将DNA吸附柱放置在离心管中，将上清全部吸入DNA吸附柱中，于室温放置2min，10 000 r/min离心1min。弃滤液，重新将吸附柱放置在离心管中，加入DNA洗涤液（10mmol/L Tris-HCl,25%无水乙醇，PH7.5），10 000 r/min离心1min。重复加入洗涤DNA洗涤液洗涤两次，再空管10 000 r/min离心1min。在吸附

11、柱中加入预热至60的TE缓冲液100L，水浴60放置2min，10 000 r/min离心1min，离心管中收集液即为土壤微生物DNA溶液，4保存。1.3DNA纯化 采用吸附柱对方法一和方法二提取的DNA样品进行纯化。在粗提DNA中加入3倍体积的DNA联接液，室温放置30min，下面步骤同方法三。方法三提取的DNA不经过纯化直接用于后续操作。1.4DNA 检测 将2L 粗提DNA样品用TE缓冲液稀释后，在BECK-MANDU-800 型紫外分光光度计上测定波长在230 nm, 260nm, 280 nm处的光密度值。根据DNA稀释液在260 nm处的光密度值计算DNA的浓度。腐植酸和蛋白质分别

12、在230 nm和280 nm处有吸收峰，通过测定260 nm/230 nm (DNA/腐植酸和260 nm/280 nm(DNA/蛋白质的比值来检测DNA的纯度。同时用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测分析。1.516SrDNA V3片段PCR PCR 反应体系：10PCR反应缓冲液5L，3.2 mmol/LMg2+，0.8mmol/LdNTP，PCR 引物各0.5mol/L，2%BSA，2.5U Taq 酶,2%BSA,模板DNA 120ng，加灭菌双蒸水补足至50L。扩增程序:在 GeneAmp PCR system 9700 PCR仪上 ,94 ,5 min；92 ,30 s；55,30 s；7

13、2 , 30 s；30 个循环；72 ,7 min。引物的序列为:F341-GC: 5 ( CGCCCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCACGGGGG GCCT ACG GGA GGC AGC AG3； R518: 5ATTACC GCG GCT GCT GG3。 PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6变性梯度凝胶电泳(DGGE DGGE采用DCODETM系统（BioRad）。16SrDNA V3PCR产物在8%聚丙烯酰胺凝中分离，变性剂梯度为40%-60%(100 %变性剂浓度为 7 mol/L 的尿素和 40 %的去离子甲酰胺的混合物。其运行条件

14、：PCR产物上样量为200-300ng。0.5TAE电泳缓冲液，65，200V，4h。按快速银染法染色：固定液（7.5%的冰乙酸）固定15min；0.2%的硝酸银染色15min；显色液（3.0%氢氧化钠,0.5%甲醛）显色5min；固定液终止反应。每一步均用去离子水冲洗胶面。在Bio-Rid公司凝胶成像系统中照像。2 结果与分析2.1土壤总微生物DNA 由图1提取的DNA凝胶电泳结果可知，三种方法提取的土壤DNA片段长均在23Kb以上，完整性好，可用于后续的分子生物学分析。根据表1的紫外分析结果，以DNA产率为指标可知，方法一提取的DNA产率最高，方法二的产率次之，方法三的产率最低。这说明反复

15、冻融裂解细胞要比水浴裂解细胞更充分。在方法三中，采用反复冻融法裂解细胞，但DNA产率明显比方法一的产率低，这与吸附柱的使用有关，说明吸附柱的使用会导致DNA损失，这与其它研究中的结论一致。以纯度作为评估指标，方法一提取的DNA 0D260/230比值最高，腐植酸去除效果最好，而方法三腐植酸去除效果最差；方法三提提取的DNA OD260/280比值最高，蛋白去除效果最好，方法一和方法二去除蛋白的效果中等。由此可知，方法三中采用异硫氢酸胍溶解蛋白，结合吸附柱的使用能够充分去除DNA中的蛋白质，但不能有效的除去大部分腐植酸；方法一和方法二采用酚-氯仿-异戊醇抽提、异丙醇沉淀和酒精洗涤处理则可以在去除

16、部分蛋白质的同时去除混合在DNA中的大部分腐植酸，获得较好质量的DNA。根据以上分析，本实验中采用异硫氢酸胍-吸附柱法对粗提方法一和方法二粗提的DNA进行纯化，获得了良好的效果。综合上述，认为DNA 提纯的最佳方案为方法一提取方法结合异硫氢酸胍-吸附柱纯化方法。FIG 1. Agarose gel electrophoresis of total DNA extracted from Bamboo soil by different methodsLaneM, bacteriophage lambda DNA digested with HindIII; Lane D1,Method 1;La

17、neD2,Method 2 ;Lane D3,Method 3 图1三种方法所提竹林土壤微生物总DNA电泳图.M,DNA-Hind分子标记D1,方法一提取的DNA; D2,方法二提取的DNA; D3,方法三提取的DNA表 13种方法提取的土壤样品的DNA纯度和浓度Table 1 The purity and concentration of DNA extracted from soil samples using three methods提取方法OD260OD280OD230OD260/280OD260/230DNA浓度ng/L方法10.02680.01590.03621.68670.74

18、0867.00方法20.02210.01410.03201.56290.690455.22方法30.00600.00300.09671.98970.062215.032.1 PCR-DGGE检测结果 土壤中有机质含量丰富，尤其是其中的腐植酸对PCR等后续操作有极大的抑制作用。本实验PCR扩增结果如图2，A、B分别为纯化的方法一和方法二提取的DNA扩增，C为直接用方法三提取的DNA扩增，N为以灭菌双蒸水为模板的扩增。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现N没有扩增产物，表明PCR没有污染。A、B、C都能成功的扩增出16SrDNA V3片段，其中C扩增条带较弱，可能因为C扩增中DNA模板不够

19、纯。将PCR产物直接上样进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）检测得到比较丰富的细菌群落多样性图谱（图2）。但方法一提取的细菌多样性明显要比方法二和方法三的高。由此可知，提取高纯度的DNA模板对PCR扩增十分关键，本实验中采用的DNA提取和纯化方法所提DNA完全能够满足实验要求，方法一提取的微生物信息最全面。FIG 2. Electrophoresis of PCR products in 1.5% agarose. .Lane M, Marker DL2000;Lane A, purified DNA of method 1 extracts ;Lane B, purified DNA of me

20、thod 2 extracts;Lane C, crude DNA of method 3 extracts; Lane N, reaction mixture only, without DNA template.图2 三种方法提取的DNA16srDNA扩增结果.M:2000bp DNA 分子标记; A,纯化的方法一DNA;B,纯化的方法二DNA; C方法三粗提DNA; N:阴性对照.FIG.3.DGGE gel illustrating the bacterial community profile of Bamboo soil obtained with DNA extraction m

21、ethods 1,2,3. 图三 三种方法提取的DNA DGGE图谱。D1、D2、D3分别为方法一、方法二、方法三提取的DNA的DGGE图谱；3 讨论 从土壤中充分裂解微生物，获得总微生物DNA是研究土壤微生物的关键。微生物细胞与土壤粘附较牢，不易分开，导致靶微生物丢失较多。Zhou等人5认为，从砂质土壤中释放微生物要比粘性土壤容易。常用机械破碎方法如玻珠振荡法2、超声波法3、液氮研磨法，或是几种方法的组合来破碎细胞6。在分子生态学研究中，大片段的DNA是用于进一步的分子生物学操作的保证。本实验在提取缓冲液中加入石英砂，使土壤充分悬浮，有助于微生物的释放。同时，物理、化学和酶联合裂解法, 即冻

22、融法、SDS 和蛋白酶K 的联合使用,获得了良好的细胞裂解效果。实验中避免了超声波等剧烈的处理，使得DNA的完整性也很好。 在土壤DNA抽提中最主要的污染物是腐殖酸，其结构千差万别，能与金属离子和很多有机分子相互作用。对于不同的土壤，腐殖酸组成和特点不同。因此，不同的土壤，同一种提取方法会有不同的提取效果。去除腐殖酸国内外大部分方法多应用PVP或是不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinyl-polypyrrolidone, PVPP 7，但可能导致DNA的损失5。另外，CTAB不仅可用于细胞裂解，还有助于去除腐殖酸5。也有报道在DNA提取缓冲液中添加2-4%的CaCl2和BSA可以去除腐殖酸8，可能是Ca2+可与DNA竞争结合DNA，形成稳定的腐殖酸钙，在后续的处理中再被去除，达到去除腐殖酸的目的。BSA则可以通过其上富含赖氨酸的阳离子与带负电荷的腐殖酸的可逆结合,降低腐殖酸与DNA的结合，同时BSA可以封闭其他杂质对酶活性的抑制，保护DNA避免降解。本方法针对竹林土壤，在提取液中都使用了CTAB，再通过过柱纯化，获得了理想的效果，DNA纯度完全能够满足后续实验的