采用红外光谱法研究改性蛋白对小麦面浆糊化的影响

1、 采用红外光谱法研究改性蛋白对小麦面浆糊化的影响*范大明 1, 陈卫 1, 庞珂 2, 唐帅坤 1, 顾小红 1, 赵建新 1, 张灏11(江南大学食品学院 食品科学与技术国家重点实验室 , 江苏 无锡 , 2141222(无锡华顺民生食品有限公司 , 江苏 无锡 ,214218 摘要钙结合 11S 蛋白作为可微波预油炸脆性剂已有研究 , 为探讨钙结合 11S 蛋白的增脆机理 , 文中运用红外光谱法考察钙结合 11S 蛋白在面食品糊化过程中对体系产生的影响 。 采用全反射傅立叶变换红外光谱法 (ATR-FTIR 结合二阶导数峰位拟合处理 , 表明预混阶段改性蛋白的添加明显增加体系蛋白质的水合特

2、征 。 糊 化阶段改性蛋白的添加使预混体系中蛋白的高水平水合降至同一水平 ,且相较空白多降低体系淀粉结晶度 10%以上 。 由此说明钙结合蛋白能有效提高体系对水的二次分配能力 , 使糊化后淀粉重结晶能力下降 , 体系趋 于稳定 。 关键词钙结合 11S 蛋白 , 红外光谱 , 糊化第一作者 :博士研究生 (陈卫教授为通讯作者 ,E-mail :weichenjiangnaneducn 。*国家科技支撑计划 (2008BAD91B03 , 农业科技成果转化资金 项目 (2008GB2B200083 收稿日期 :20110402, 改回日期 :20110621可微波预油炸食品的脆性保持是当今食品工

3、业 的热点问题 。 相关文献 1表明 , 疏水性蛋白可以在 油炸食品表面形成一层凝胶 , 阻止水分的外逸 , 增加 淀粉膜强度 , 有助于提高表皮脆性 。 Suhaila Mohamed 研究表明 , 向面糊中添加 CaCl 2也可以降低油的吸收 率以及提高产品脆性2。糊化过程作为面食品的熟化过程 , 直接影响食品的质构特性 , 对油炸面食品的脆性更是起到决定性作 用 。 Stanstedt3研究在面团加热过程中 , 淀粉糊化导致水从蛋白质向淀粉转移 。 Bushuk 得出没有水被束缚在面包的面筋蛋白中 ,77%的水连接在淀粉中 , 23%连接戊聚糖 4, Eliasson 运用 DSC 监视

4、淀粉糊化 过程 , 在淀粉蛋白混合加热的过程中 1. 00g 蛋白与 0. 48g 水连接 5。 红外光谱技术的发展为测定糊化 过程面浆体系的变化提供了新的分析方法 。 衰减全反射傅立叶变换红外光谱 (ATR-FTIR 技术被近年来 广泛应用于检测水溶液中的样品 , 或者含水量较多的样品 6。 由于蛋白和多糖的红外特征吸收带有显著 差异 , 所以可以同时研究他们在混合物中的行为 。 前文围绕着预油炸面食品微波复热后的脆性进 行的一系列研究表明 , 钙结合 11S 蛋白对提高预油炸 面食微波加热后的脆性有明显效果 7, 预冻期间的冷冻速率对样品的脆性影响大 , 低温冻藏产品脆性 高 , 保持的时

5、间长8, 并且发现加入改性蛋白后 , 面浆体系的糊化温度升高 、 黏度减小 , Ca 结合 11S 蛋白 有效延缓春卷皮的短期回生和长期回生特性9。 在先前研究的基础上 , 为探讨改性蛋白增脆机理 , 本文运用 ATR-FTIR 考察钙结合 11S 蛋白在糊化过程中 对面浆中淀粉 、 蛋白质及整个体系产生的影响 , 以期 能为后续探讨其脆性改良的方式 、 开发功能性食品添 加剂奠定基础 。1材料与方法1. 1材料低筋小麦粉 , 中粮集团 (秦皇岛鹏泰有限公司 ;低温脱脂大豆粉 , 山东禺王实业有限公司 ; 大豆分离 蛋白 , 东营万得福植物蛋白科技有限责任公司 ; 淮牌 精制 海 盐 , 江

6、苏 省 盐 业 集 团 有 限 责 任 公 司 ; 无 水 CaCl 2, 上海泗连化工厂 ; 其他为分析纯试剂 。 1. 2仪器LXJ- 沉淀离心机 , 上海医用分析仪器厂 ; FD53热风循环烘箱 , 德国 Binder 公司 ; PB2002-N 型天平 , Metller-Toledo 公司 ; THS-15超级水浴恒温槽 , 上海医 疗器械工厂 ; Delta320pH 计 ,Metller-Toledo 公司 ; 喷 雾干燥塔 , 无锡东升喷雾造粒干燥机械厂 ; 超低温冰 箱 , 鑫科企业有限公司 ; Nexus470傅里叶变换红外光谱仪 , 美国 Thermo Necolet 公

7、司 。 1. 3实验方法1. 3. 111s 大豆蛋白 、 钙结合 11S 蛋白的制备方法按参考文献 7方法制备 。1. 3. 2FTIR 测定面浆糊化特性的方法分析采用美国 Thermo Necolet 公司的 Nexus 470 研究报告 27傅里叶变换红外光谱仪 , 配备三醋酸硫酸酯 (DTGS 检测器 , 衰减全反射 (ATR 附件 (基底材料为 ZnSe ,OMNI 采样器 , ATR 的入射角为 45 , 光谱范围 4000650cm 1, 分辨率为 4cm 1, 扫描累加 64次 。将 11S 蛋白 、 钙结合 11S 蛋白添加量为 43mg /g的小麦面粉分别加水制成料液比为

8、1 9(g mL 的浆料 , 取 5mL 浆料加入变温 ATR 中 , 以 10 /min升温 , 到 95 后 , 平衡 10min , 以相同温度下的 5mL 水作为背景 , 采集红外光谱图 ; 对浆料糊化前后状态进行测定 。利用 OMNIC 6. 2智能操作软件处理得到的 FTIR图谱 , 进行基线校正 、 去卷积操作 , 设定半峰宽与增强因子 。 用 Peakfit 4. 12软件进行二阶导数峰拟合 , 得到 9个子峰 , 其残差 (r 2 大于 0. 96, 确认峰位归属 ,计算各子峰面积的相对百分含量 。2结果与分析2. 1预混阶段面浆体系的变化糊化前 , 将样品以 300r /m

9、in混合 20min , 确保体系均匀 , 此时测试未加热的小麦面浆红外光谱 , 见图1。 可见仅在搅拌 、 混合过程中蛋白质就对面浆体系产生了影响 。在 1200 850cm 1的范围内 , 也就是所谓的指纹区 , 各碳水化合物都有很强的特征吸收 10。 图中1150, 1124和 1103cm 1附近的吸收峰为 C O C的伸 缩 振 动 和 C C 、 C H 的 骨 架 振 动 ; 而 1080cm 1附近的振动则是 C O 的伸缩振动和 C C 的骨架振动的复合表现 。 添加 2种蛋白后的样品在以上峰位均表现出强度的下降 , 以添加 11S 蛋白样品尤其突出 。 这与文献相符 11,

10、 随着麦谷蛋白的添加和混合时间的延长 , 酰胺带强度在慢慢增加 , 淀粉带强度慢慢降低 。a 空白 ; b 加钙结合 11S 蛋白 ; c 加 11S 蛋白图 1混合 20min 未糊化小麦面浆红外谱图在 1800至 1500cm 1的范围内 , 1640cm 1(酰 胺 带 C O 伸缩振动 、 OH 弯曲 振 动 、 1550 cm 1(酰胺 带 NH 弯曲振动 、 CN 伸缩振动 , 如图 1所示 , 随蛋白质的添加酰胺 带吸收峰增强 、 酰胺 带吸收峰减弱 。 这主要是由于蛋白质的水合作用造 成偶 极 离 子 的 瞬 间 改 变 从 而 使 酰 胺 带 的 峰 增 强 12。2. 2糊

11、化前后体系中淀粉的变化将图 1中 3种样品以 10 /min升温至 95 , 平 衡 20min 后进行红外扫描 。 由图 2可知 , 小麦面粉 糊化前后显示出明显的变化 , 导致分子有序结构的改 变 , 在 1200 800cm 1区域的特征红外谱带是水合 后淀粉低聚糖和多糖的特征峰 , 其明显变大 , 主要包 括 1148、 1106、 1077、 1040、 992和 933cm 1, 值得 注意的是 1047cm 1与 1022cm 1代表结晶结构的 特征峰 13, 经去卷积 , 计算结晶度 。a 糊化面浆 (原曲线 ; b 糊化面浆 (去卷积曲线 ;c 未糊化面浆 (原曲线 ; d

12、未糊化面浆 (去卷积曲线 图 2小麦面粉糊化前后红外光谱图 (1200 900 cm 1 在 1047cm 1附近的红外吸收是淀粉结晶区的 结构特征 , 对应于淀粉聚集态结构中的有序结构 ; 1022cm 1附近的红外吸收则是淀粉无定形区的结 构特征 , 对应于淀粉大分子的无规线团结构 1416; 930cm 1附近的吸收峰则为葡萄糖环的振动吸收峰 。 可以看出 , 对添加蛋白的面浆 , 其红外吸收峰的位置 并无差别 , 但吸收峰的峰形和强度却因添加蛋白种类 的不同而有所差异 , 尤其是在 1047cm 1和 1022 cm 12处的吸收峰强度 。 经过 OMNIC 6. 2软件进行 去卷积处

13、理后的室温下的 FTIR 图谱见图 3。经计算 , 不同体系的结晶度见表 1, 糊化后体系 中淀粉的结晶度从 66. 12%降至 51. 97%, 添加 11S 蛋白与钙结合 11S 蛋白的面浆糊化后结晶度较空白 面浆中淀粉均低 10%左右 。 说明钙结合蛋白的添加 降低了糊化后体系中淀粉的结晶度 。 a 空白 ; b 加 11S 蛋白 ; c 加钙结合 11S 蛋白图 3添加不同蛋白小麦面粉糊化后红外光谱图(1200 900cm 1表 1小麦面粉糊化前后淀粉结晶度序号 样品R 峰高比值 (1047cm 1/1022cm 1 1糊化前空白小麦面浆66. 12% 0. 84%2糊化前加 11S

14、蛋白小麦面浆 65. 09% 0. 47%3糊化前加钙结合 11S 蛋白小麦面浆 63. 62% 0. 96%4糊化后空白小麦面浆51. 97% 0. 54%5糊化后加 11S 蛋白小麦面浆 41. 04% 1. 14%6糊化后加钙结合 11S 蛋白小麦面浆 42. 27% 0. 94%注 :半峰宽 24. 5、 增强因子 2. 7。2. 3体系中蛋白质酰胺 带的变化加热阶段面浆中的蛋白质运用其与水分子的共价与非共价相互作用 ,综合影响体系中淀粉的性质 , 这些反应通过搅拌 、 自发迁移等作用 , 具体划分为(1 S S 的分裂 ; (2 主键的断开与破损 ; (3 S S 与 SH 的相互转

15、换 ; (4 二酪氨酸交叉结合 的形成 ; (5 新二硫化物的交叉结合 ; (6 基本反应和 基本反应再定位导致的氢键增强 。 这些反应造成了 蛋白质二级结构的变化 , 所以本实验将红外谱图中的 酰胺 带进行峰度拟合 , 考察体系中蛋白质的变化 , 进而探讨对面浆体系的整体影响 。参照多篇文献中报道的峰位归属 , 锁定拟合图中 各峰位置 , 确保考察体系条件均一 , 拟合后的图谱见 图 4, 计算各峰面积所占比率见表 2。 面团的黏性和 均一性被认为是在重复区域通过亲水侧链的氢键网络形成的排列好的 -折叠片层起作用 , 在混合 、 糊化 过程中 , S S 断开 , 所有面筋蛋白相互作用 ,

16、改变结构的机会增加了 , 这种反应使 -螺旋和 -转角 减少 , -折叠片层增加11。 本实验中添加 Ca 结合蛋白的面浆在 1686 1680cm 1及 1622 1613cm 1范围的 -折叠片层含量较空白样品有明显提高 。 在预混阶段 , 随着钙结合蛋白的添加 , 体系中游离的 -折叠股呈现减少 、 -折叠片层增加 , 说明预混阶段随 着 Ca 结合蛋白的添加 ,在 Ca 2+的络合作用下 -折叠 股被部分转变成 -折叠片层结构 。 由表 2同时可 见 ,糊化后 -转角减少 、 -折叠片层增加 , -转角转 变成 -折叠片层的过程 , 是通过临近蛋白亚单位中 的氢键新生成的共价稳定结构

17、, 分子结构上折叠片层 的增 加 毫 无 疑 问 有 利 于 特 征 性 改 变 体 系 的 稳 定 性 15。a 加 11S 蛋白 ; b 加钙结合 11S 蛋白图 411S 蛋白与钙结合 11S 蛋白酰胺 带峰位拟合图2. 4体系中蛋白质酰胺 带的变化酰胺 带主要是平面 C N H 弯曲振动结合 C N 伸缩震动所形成的吸收峰 17, 可以观察到分子 间经过氢键的相互作用以致水合 , 这个过程是高度敏 感的 , 前人工作得到一较大吸收峰的改变 , 即从干蛋白 1512cm 1转变成高度水合的 1547cm 1, 在红外光谱去卷积后 , 酰胺 带中 1547cm 1与 1512cm1的比率可

18、以反应体系中水与蛋白的作用程度 。 文 献 18中阐述了在小麦面浆体系中 ,R (1547cm 1/1512cm 1 可以用来评估面筋蛋白的水合程度 。 实验中空白与添加改性蛋白的体系在糊化后均有不同程度的降低 , 即酰胺 带特征 IR 比率与温度 呈负相关 , 见图 5、 表 3。 这些一致性结合预混阶段的 实验结果暗示了水的添加导致了蛋白分子的内氢键断开 , 形成水 -蛋白氢键 19, 然而当被加热时 , 水 -蛋白 氢键被蛋白与蛋白的相互作用所替代 。 由表 3可知 , 11S 蛋白与 Ca 结合 11S 的添加使体系中蛋白的水合 能力上升 , 较未添加蛋白体系均有较大幅度提高 ; 糊

19、化后空白样品体系中蛋白水合特征变化很小 , 几乎不 变 , 而添加蛋白体系明显降低 , 证明 11S 与钙结合研究报告 29 11S 蛋白的添加有效改变体系中蛋白质的性质 , 这对糊化过程中水分在各成分间的运输与变化起到很大作用 。表 2含不同蛋白小麦面浆体系酰胺 带特征谱带归属及含量波数 /cm1参考文献 结构特征糊化前空白 加 11S 蛋白加 Ca 结合11S 蛋白糊化后空白 加 11S 蛋白加 Ca 结合 11S 蛋白 1686 1 6802022-折叠片层 , 反向平行 2. 53%0 . 04%3. 7%0 . 09%3. 39%0 . 13%0. 66%0 . 04%1. 46%0

20、 . 08%1. 22%0 . 11% 1677 1 66620, 23-转角 29. 50%0 . 13%24. 39%0 . 17%25. 740 . 26%19. 89%0 . 15%18. 20%0 . 17%18. 80%0 . 08% 1662 1 65920, 24-转角及无规则结构 9. 90%0 . 09%11. 28%0 . 16%7. 80%0 . 14%10. 61%0 . 11%8. 27%0 . 08%9. 10%0 . 14% 165521, 25-螺旋 2. 78%0 . 03%8. 23%0 . 04%7. 89%0 . 09%1. 98%0 . 03%5.

21、08%0 . 04%3. 92%0 . 03% 1651 1 64820, 26氢键水合 -螺旋 18. 28%0 . 11%10. 22%0 . 18%16. 33%0 . 26%17. 93%0 . 07%11. 61%0 . 10%14. 54%0 . 16% 16442021,2425无序结构 0. 18%0 . 17%3. 98%0 . 04%0. 25%0 . 02%0. 69%0 . 09%2. 27%0 . 04%1. 62%0 . 07% 1640 1 63721, 23,2425弱氢键 -折叠股 22. 94%0 . 24%15. 21%0 . 16%18. 37%0 .

22、10%21. 92%0 . 24%20. 18%0 . 22%20. 94%0 . 28% 1633 1 6252326强氢键 -折叠股 4. 48%0 . 08%7. 34%0 . 37%7. 08%0 . 07%10. 78%0 . 15%11. 70%0 . 14%10. 84%0 . 18% 1622 1 61320, 2425-折叠片层 , 延展及分子内耦合9. 39%0 . 14%15. 56%0 . 33%13. 44%0 . 21%15. 54%0 . 11%21. 22%0 . 09%19. 00%0 . 11%a 空白 ; b 加钙结合 11S 蛋白 ; c 加 11S 蛋

23、白图 5糊化后体系酰胺 带去卷积红外谱图表 3小麦面粉糊化前后蛋白水合特征值序号 样品R 峰高比值(1547cm 1/1512cm 11糊化前空白小麦面浆 1. 867 0. 0142糊化前加 11S 蛋白小麦面浆 2. 722 0. 0483糊化前加钙结合 11S 蛋白小麦面浆 3. 015 0. 0364糊化后空白小麦面浆 1. 655 0. 0515糊化后加 11S 蛋白小麦面浆 1. 299 0. 0346糊化后加钙结合 11S 蛋白小麦面浆 1. 419 0. 027注 :半峰宽 45、 增强因子 2. 2。2. 5蛋白质对糊化过程的整体影响结合预混过程与糊化过程中蛋白质与淀粉的变化

24、 , 反应了面浆物理化学性质上的改变 , 其中水的作用是整个体系中变化的关键因素 27。预混阶段蛋白质的添加 , 比较明显的增加体系中蛋白质的水合特征 ; -螺旋增加 、 与水结合的 -螺旋减少 、 弱氢键的 -折叠股减少 、 强氢键的 -折叠股增加 , 说明自螺旋结构增加 、 与水结合的螺旋结构减少 ,-折叠股中强氢键增加 , 同时 -折叠片层结构也有增加 ; 此阶段对淀粉分子的结晶度影响甚微 。糊化阶段蛋白质的添加 , 使预混阶段体系中的蛋 白质较高的水合程度降至同一水平 , 其中钙结合 11S 蛋白降低数达到 1. 596, 11S 蛋白为 1. 423; 整体螺旋 结构减少 , -折叠

25、股达到同一水平 , 结构数量明显增 大 ; 此阶段对淀粉分子的结晶度影响很大 , 11S 蛋白 与钙结合 11S 蛋白均较空白多降低体系中淀粉结晶 度 10%以上 。 自行制备的蛋白质的添加使体系在混 和阶段将水分大多与蛋白质结合 , 在升温阶段逐步释 放水分 , 使体系中淀粉在糊化的不同阶段氢键稳步增 加 。 糊化结束后蛋白的脱水程度大于空白体系 , 表现 出自行制备的蛋白质有效提高体系对水的二次分配 机制 , 使其更有效的达到所需效果 , 使反应结束后体 系中淀粉的结晶度下降 , 重结晶能力降低 , 体系更趋 于平均 。 -折叠片层明显增大 , 即片层结构的增加对 面制品的结构稳定性也有明

26、显提高 28。综上所述 , 钙结合大豆蛋白的添加首先在混和阶 段调节了水分在浆料中的分配 , 使面浆中的整体蛋白 质吸收大量的水分 。 糊化过程中 , 在较低温度下 , 添 加的钙结合蛋白与淀粉颗粒竞争水合 , 一方面导致淀 粉颗粒糊化缓慢 , 另一方面使体系蛋白质自身氨基键 强减弱 。 在较高温度下 , 蛋白质受热分子内氢键断 裂 , 蛋白分子内部疏水基团 SH 由于加热变性而大 量暴露出来 , 阻碍了淀粉分子之间的聚合缠绕 , 与此 同时亲水基团所结合的水分缓慢释放 , 释放出来的水 分进一步促进淀粉颗粒崩溃解体 。 糊化结束后 , 钙结 合大豆蛋白在体系中的均匀分布阻碍了淀粉分子间 的结

27、晶作用 , 但钙的络合作用使体系中整体蛋白质结 合的水分充分释放 、 螺旋结构充分展开 , 以规则的蛋 白片层形态结合充分糊化的淀粉构建了高度有序的淀粉 ·蛋白质复合体系凝胶结构 。 由此可见 , 钙结合 蛋白在面浆体系预混及糊化过程前后的综合作用 , 形 成了面皮体系所表达的质构脆性特征 。3结论(1 红外光谱分析糊化前混和阶段体系的变化 表明 , 预混阶段蛋白质的添加增加体系中蛋白质的水 合特征 ; 自螺旋结构增加 、 与水结合的螺旋结构减少 , 强氢键 -折叠股增加 , 同时 -折叠片层也有增加 ; 此 阶段对淀粉分子的结晶度影响甚微 ; (2 红外光谱分析糊化后体系的变化表明

28、 :糊化阶段蛋白质的添加 , 使预混阶段体系中的蛋白质较高的水合程度降至同一水平 ,其中钙结合 11S 蛋白降低数达到 1. 596, 11S 蛋白为 1. 423; 整体螺旋结构减少 , -折叠股达到同一水平 、 -折叠片层明显提高 ; 此阶段对淀粉分子的 结晶度影响很大 ,11S 蛋白与钙结合 11S 蛋白均较空 白多降低体系中淀粉结晶度 10%以上 ; (3 规则的蛋 白片层形态结合充分糊化的淀粉构建了高度有序的 淀粉 -蛋白质复合体系凝胶结构 , 钙结合蛋白在面浆 体系预混及糊化过程前后的综合作用 , 形成了面皮体 系所表达的质构脆性特征 。参考文献1Mohamed S. Food C

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