青蒿素对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长和淋巴管生成的影响

1、青蒿素对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长和淋巴管生成的影响    作者：郭燕，王俊，章必成，陈正堂，高建飞，赵勇 【关键词】 青蒿素；癌,Lewis肺；淋巴管生成；血管内皮生长因子 Effect of artemisinin on metastatic tumor growth and lymphangiogenesis in mice bearing Lewis lung carcinoma 【Abstract】 AIM： To explore the effect of antimalarial artemisinin on Lewis lung car

2、cimoma (LLC) growth and tumor lymphangiogenesis. METHODS： The models of LLC in C57BL/6 mice were established via subcutaneous injection of mouse LLC cells. After mice were orally administered with artemisinin at 50 mg/kg body weight, once 2 d for 2 weeks, tumors were measured with calipers twice wee

3、kly. Mice were sacrificed 30 d following tumor cell injection, and Lewis tumors and lungs were harvested and weighted. Lewis tumors and lungs were processed for immunohistochemical analysis for lymphangiogenesis using VEGFR3 and LYVE1 staining or for micrometastasis using HE staining. Lymphatic micr

4、ovessel density (LMVD) was evaluated by LYVE1 positive lymphatic vessel count. Furthermore, mice were monitored for survival studies. RESULTS： LMVD, wet weight of lungs and number of lung metastasis in artemisinintreated group were significantly lower as compared with control group (P<0.05). Howe

5、ver there was not statistically significant difference in tumor growth between artemisinintreated mice and control mice (P>0.05). In addition, artemisinintreated mice lived significantly longer than the control mice did (P<0.01). CONCLUSION： Antimalarial artemisinin effectively inhibits the ly

6、mphangiogenesis and lung metastasis, and enhances the survival of mice bearing LLC. 【Keywords】 artemisinin; carcinoma, Lewis lung; lymphangiogenesis; vascular endothelial grouth factorc 【摘要】 目的： 探讨抗疟药青蒿素对Lewis肺癌生长和淋巴管生成的作用. 方法： 通过接种（sc）Lewis肺癌细胞建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，灌胃给予50 mg/kg的青蒿素，1次/2 d，连续给药2 w

7、k；游标卡尺观察给药后肿瘤体积变化. 接种后第30 d处死动物，收集肿瘤组织和双肺组织，并称质量. 免疫组化检测瘤内和瘤周VEGFR3和LYVE1表达，计数LYVE1阳性淋巴管并计算微淋巴管密度，HE染色肺组织计数肺转移结节数，观察荷瘤小鼠的存活率. 结果： 与对照组比较，青蒿素组瘤内LMVD，肺湿重，肺转移发生率和肺转移结节数均较低（P<0.05）；青蒿素治疗组与对照组移植瘤生长没有明显差异（P>0.05）；青蒿素治疗组小鼠存活率与对照组比较明显增加（P<0.01）. 结论： 青蒿素可有效抑制Lewis肺癌淋巴管生成和肺转移，并提高小鼠存活率. 【关键词】 青蒿素；癌，Le

8、wis肺；淋巴管生成；血管内皮生长因子C 0引言淋巴结转移是多种肿瘤转移的重要途径，也是肿瘤预后的重要指标. 近年研究显示，肿瘤可以诱导淋巴管生成（lymphangiogenesis），并促进肿瘤细胞通过新生的淋巴管向区域淋巴结转移. 目前，多种淋巴管内皮特异性标记物的发现促进了人们对肿瘤淋巴管功能的认识，因此寻找可以抑制淋巴管生成的药物和方法已经成为抗肿瘤转移研究领域的热点1. 青蒿素（artemisinin）是1972年由我国科研人员从中药青蒿中分离得到的，具有抗疟作用的单体成分，现在临床上主要用于治疗耐药的恶性疟疾. 多项研究表明，青蒿素及其衍生物对多种肿瘤的生长具有抑制作用，并显示出较

9、强的抗血管生成活性2. 然而，青蒿素是否可以抑制淋巴管生成还不清楚. 我们探讨了青蒿素对小鼠Lewis肺癌生长、淋巴管生成和肺转移的影响. 1材料和方法 1.1材料健康C57BL/6小鼠50只，雌性，46周龄，体质量18.120.3 g，由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供. 小鼠Lewis肺癌细胞株购于美国典型菌株保藏中心（ATCC），使用DMEM（含10 mL/L灭活胎牛血清、100 U/mL青、链霉素）培养基，置于37，50 mL/L CO2孵箱中培养. DMEM、胎牛血清购于美国Hyclone公司. 胰蛋白酶，美国BD公司. 青蒿素购自重庆市酉阳县武陵山制药有限公司，研磨后用5 g/

10、L的羧甲基纤维素钠配成悬浮液. 兔抗小鼠VEGFR3, LYVE1多克隆抗体购买自美国Santa Cruz Biotechnology公司. 免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司. 收集对数生长期的细胞，胰酶消化后，1000 r/min离心10 min，PBS洗涤，无血清的DMEM制成细胞悬液，细胞浓度达到5×106. 随机选取6周龄的C57BL/6小鼠，在背部皮肤下接种Lewis肺癌细胞，每只0.1 mL. 1.2方法将20只小鼠随机分为对照组和青蒿素治疗组，每组10只，青蒿素治疗组在肿瘤移植后2 d即灌胃给予50 mg/kg青蒿素0.4 mL，1次/2 d

11、，连续给药2 wk；对照组灌胃相同体积的羧甲基纤维素钠悬液. 每23 d用游标卡尺测量肿瘤最大长径（a）和与之垂直的宽径（b），并计算肿瘤体积：V0.52ab2. 移植后30 d脱臼处死小鼠，剥离肿瘤组织，取出肺组织，称取瘤体和肺质量. 肺组织用40 g/L甲醛固定24 h，石腊包埋，切片，常规HE染色，计算光镜下的平均结节数. 另取30只小鼠随机分为对照组和青蒿素治疗组，每组15只，观察生存期. 肿瘤组织切片用二甲苯脱腊，梯度酒精水化，30 mL/L H2O2室温封闭10 min，98微波热修复抗原10 min. SABC染色步骤如下：先用20 mL/L正常山羊血清封闭30 min，甩去不洗

12、，随后滴加兔抗小鼠VEGFR3及LYVE1（1500），4过夜，PBS洗涤，滴加生物素化的羊抗兔IgG（1100），37孵育30 min，PBS洗涤，加入SABC，37孵育30 min，DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木素衬染，中性树胶封片. 光镜下观察微淋巴管密度（lymphatic microvessel density, LMVD）并计数，参考Beasley等的方法3，即先在低倍数下（×100）观察切片，寻找肿瘤内染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞簇，作为一个微淋巴管，含有肌层的细胞不以计数，每个标本在高倍镜下（×400）随机计数10个视野，取平均数作为该LMV

13、D值.    统计学处理： 计量资料用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件包进行分析. 两率的比较用Fisher确切概率法，均数比较用t检验，生存率估计用KaplanMeier法，并用logrank检验，P<0.05表示差异具有统计学意义. 2结果 2.1Lewis肺癌移植瘤的生长小鼠接种Lewis肺癌细胞后8 d，在青蒿素治疗组和对照组小鼠背侧皮下均有肉眼可见的肿瘤病灶. 接种后15 d和20 d肿瘤生长在两组之间没有统计学差异（P>0.05，图1）. 30 d脱臼处死小鼠，称量肿瘤重量，发现治疗组和对照组肿瘤也无显著差异(P

14、>0.05，表1）. 图1青蒿素治疗肿瘤生长动态变化略 表1青蒿素对自发性Lewis肺癌生长和肺转移的影响(略)    2.2Lewis肺癌的淋巴管生成通过检测瘤周和瘤内VEGFR3和LYVE1表达，我们发现VEGFR3和LYVE1主要表达在瘤周间质（图2A，B），定位于淋巴管内皮表面，而在瘤内表达极少，仅表达于少量肿瘤细胞和间质细胞（图2C，D）. 以LYVE1阳性淋巴管计算LMVD，高倍镜（× 400）下显示，青蒿素治疗组平均LMVD为（9.8 ± 4.2）个，对照组为（34.8 ± 6.5）个，两者之间具有显著性

15、差异(P<0.01，表1）. 2.3Lewis肺癌的肺转移脱臼处死接种后30 d的小鼠，摘取双肺，电子天平称质量，并制作石腊切片，HE染色观察肺转移灶. 结果显示，与对照组比较，青蒿素治疗组双肺重量明显减轻（P<0.05，表1）；而且青蒿素组双肺转移的发生率为50%，对照组为100%，两者具有显著性差异（P<0.05，表1）；此外，治疗组双肺转移平均结节数和转移灶大小也明显小于对照组（P<0.01，表1）. 2.4荷瘤小鼠的生存期青蒿素治疗后观察小鼠死亡情况，对照组荷瘤小鼠在19 d开始死亡，在55 d时全部死亡. 青蒿素治疗组在36 d开始死亡，在60 d时仍有73%

16、存活，明显高于对照组（P<0.01，图3）.    图2图3略 3讨论 近年的研究证实，肿瘤淋巴管生成与淋巴结转移以及远处转移密切相关，LMVD和微淋巴管浸润（lymphantic vessel invasion, LVI）是独立的非小细胞肺癌预后指标4. 在实体肿瘤中，肿瘤细胞或其他间质细胞高表达（vascular endothelial growth factor, VEGF）C, VEGFD，通过激活VEGFR3诱导淋巴管生成，增加的淋巴管密度使得肿瘤更容易进入淋巴管从而运输到区域淋巴结5-6. 目前，人们已经使用多种方法来靶向抑制VEGFC

17、/VEGFD/VEGFR3信号通路，以期望通过抑制淋巴管生成从而降低肿瘤转移. 然而，这些分子靶向措施目前还处于实验阶段，用于临床尚需时日. 青蒿素是在世界范围内治疗治疗脑型疟疾和恶性疟疾的主要药物，副作用少. 近年的研究发现青蒿素及其衍生物具有较强的抗肿瘤作用，而且可抑制血管内皮细胞的迁移、存活和体外血管形成7. 在一项体外抗肿瘤实验中发现，青蒿琥酯对肠道肿瘤细胞和白血病细胞的抑制作用较强，而对肺小细胞癌细胞的杀伤作用较弱，其作用强度不到肠肿瘤细胞和白血病肿瘤细胞的1/208. 我们应用Lewis肺癌模型，观察了青蒿素对荷瘤小鼠的保护作用，结果显示，50 mg/kg的青蒿素可以显著延长荷瘤小

18、鼠生存期，但并未减轻肿瘤负荷. 提示青蒿素对Lewis肺癌的抑制作用较弱，其保护作用可能不是由于它对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用. VEGFR3, LYVE1, Prox1, D240和Podoplanin是常用的淋巴内皮标记物，可以用于肿瘤LMVD计数，从而评价肺癌患者的预后. 我们使用VEGFR3和LYVE1免疫组化染色标记微淋巴管，并以LYVE1阳性管腔计数LMVD. 实验发现，在Lewis肺癌内少有VEGFR3或LYVE1阳性表达，而在实体肿瘤周围有大量新生的微淋巴管. 某些研究认为，瘤周高LMVD而不是瘤内LMVD与肿瘤侵袭和转移相关；瘤体产生的静水压将瘤内淋巴管压扁使其不具有功能，而

19、瘤周提供了一个潜在的低张、低压和大容量环境，更有利于肿瘤细胞的渗透和播散9. 我们发现青蒿素治疗组瘤周LMVD计数明显少于对照组，提示青蒿素具有显著的抗肿瘤淋巴管生成的作用. 此外，由于Lewis移植瘤具有高转移至肺的特点；淋巴管生成与肿瘤远处转移也具有相关性10，因此我们观察了青蒿素对肿瘤肺转移的影响，结果显示青蒿素显著降低肺转移灶大小，并减少肺转移结节数. 因此，青蒿素可能是通过抑制肿瘤肺转移从而提高荷瘤小鼠存活率. 关于青蒿素抗淋巴管生成的机制，我们认为其与青蒿素的抗血管生成作用相类似，青蒿素可能从多种途径发挥作用，如抑制肿瘤细胞VEGFC表达；抑制核转录因子NFB活性或诱导淋巴管内皮细

20、胞凋亡11-12. 综上所述，淋巴管生成是肺癌发生淋巴结转移过程中的重要事件，寻找拮抗肿瘤淋巴管生成的药物是抑制肿瘤转移的重要策略之一. 将抗疟疾药物青蒿素用于拮抗淋巴管生成为拓宽其药理作用范围提供了方向，但其作用机制有待进一步研究. 例如利用已经获得的淋巴管内皮细胞13，观察青蒿素及其衍生物对细胞增殖、迁移和凋亡的影响. 【参考文献】 1 Achen MG, Mann GB, Stacker SA. Targeting lymphangiogenesis to prevent tumour metastasisJ. Br J Cancer, 2006, 94(10):1355-1360. 2

21、 Efferth T, Benakis A, Romero MR, et al. Enhancement of cytotoxicity of artemisinins toward cancer cells by ferrous iron J. Free Radic Biol Med, 2004, 37(7):998-1009. 3 Beasley NJ, Prevo R, Banerji S, et al. Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node metastasis in head and neck cancer J. Cancer R

22、es, 2002, 62(5):1315-1320. 4 Takanami I. Lymphatic microvessel density using D240 is associated with nodal metastasis in nonsmall cell lung cancer J. Oncol Rep, 2006, 15(2):437-442. 5 Staker SA, Achen MG, Jussila L, et al. Lymphangiogenesis and cancer metastasis J. Nat Rev Cancer, 2002, 2(8):573-578

23、. 6 李宏宏, 雷霆, 司履生. VEGFC与乳腺癌的关系 J. 第四军医大学学报, 2002,23(B1):44-46. 7 Chen HH, Zhou HJ, Fang X. Inhibition of human cancer cell line growth and human umbilical vein endothelial cell angiogenesis by artemisinin derivatives in vitro J. Pharmacol Res, 2003,48(3):231-236.    8 Efferth T, Olbrich A, Bauer R. mRNA expression profiles for the response of human tumor cell lines to the antimalarial drugs artesunate, arteether, and artemether J. Biochem Pharmacol, 2002,64(4):617-623. 9 Padera TP, Kadambi A, di Tomaso E, et al. Lymphatic metastasis in the absence