反复冻融对荧光实时定量PCR质粒标准品的影响研究

1、反复冻融对荧光实时定量PCR质粒标准品的影响研究    Money is the root of all evil.                        作者：王亨莉，陈红涛，孔梅，杨冬铭 It is right to put everything in its proper use.  【摘要】&

2、#160; 目的 评价反复冻融对不同浓度的real-time PCR质粒标准品的影响。方法 用大肠杆菌DH5感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒，紫外分光光度计定量后，根据重组质粒分子量计算其拷贝数，稀释成梯度浓度的荧光实时定量 PCR的标准品，取1.0×106拷贝/l、1.0×104拷贝/l 和1.0×102拷贝/l高中低3个浓度的标准品，反复冻融1次，6次，11次，16次和21次后，以冻融后的质粒标准品为模板同时进行real-time PCR扩增定量，比较量值变化。结果 反复

3、冻融21次以内，高中值稳定，低浓度波动相对较大，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。结论 >1.0×104拷贝/l的高中浓度的质粒标准品可以耐受21次以内反复冻融，低于1.0×104拷贝/l的质粒标准品反复冻融后量值变化较大，临床使用的试剂盒所配的低浓度标准品应避免反复冻融()。 【关键词】  实时定量 PCR;质粒DNA标准品【Abstract】 Objective To evaluate fr

4、eezing and thawing repeatedly influencing plasmid DNA standards for fluorescence quantification real-time PCR.Methods The recombinant PMT-18 plasmid was cloned in the Escherichia coli D

5、H5a cells. The concentrations of plasmid stocks were determined by the Eppendorf Biophotometer, and the copy number of each plasmid was calculated based on its molecular 

6、weight. Plasmid standards were made by preparing serial 10-fold dilutions, the plasmid standards were stored at -20. After freezing and thawing plasmid standards 1, 6, 11,

7、0;16 and 21 times repeatedly, quantity value diversity of different concentration standards was confirmed by real-time PCR.Results Freezing and thawing less than 21 times, and 

8、;there was no significant change observed in high and mid concentrations of plasmid standards, but low concentrations of plasmid standards was varied. The largest variation of

9、 high concentration plasmids was 0.06 lg, the largest variation of mid concentration plasmids was 0.18 lg, and the largest variation of low concentration plasmids was 0.3

10、4 lg.Conclusion Plasmid standards more than 1.0×104copies/l is stable within freezing and thawing 21 times, plasmid standards less than 1.0×104copies/l is affected after freez

11、ing and thawing repeatedly, the low concentration standard in clinical diagnosis kit should avoid freezing and thawing repeatedly.None but a wise man can employ leisure well.  【Key words】 real-time

12、60;quantitative PCR; plasmid DNA standard基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR快速高效，灵敏度和特异性高，无需 PCR后处理，是目前疾控系统和临床检验定量检测核酸应用最为广泛的一种方法13。实时荧光定量 PCR的质量保证最为重要的一个因素就是标准品，定量结果的准确性在很大程度上依赖于标准品的准确性。目前实时荧光 PCR定量标准品大多为重组质粒47，重组质粒为裸露的螺旋缠绕的双链闭环DNA，质粒在低温条件下可长期稳定保存，与目的基因保持较高的同源性，两者一致的扩增效率是得到较为可

13、靠的定量结果的保证。裸露的双链DNA化学稳定，但物理结构易碎，在受到搅拌、振荡或反复抽吸时，DNA双链容易被拉断，结构被破坏后，DNA序列不再完整，参与PCR反应时扩增效率降低，影响定量8。反复冻融的过程中，液固状态的体积会发生变化，对DNA质粒结构会产生力学作用。本实验结合临床检验人员的工作经验，研究实时荧光定量PCR诊断试剂盒临床检测中可能的冻融次数对不同浓度的质粒标准品的影响。1 材料与方法Riches do not always bring happiness.  1.1 材料Good counsel never comes too late. 

14、 1.2 方法Good counsel never comes too late.  2 结果2.1 重组质粒的克隆和测序 重组质粒在感受态细胞大肠杆菌DH5中培养增殖后回收质粒DNA。经测序验证，插入pMD18-T载体的目的片段大小为112bp，序列为GGGTGTAATGTGAAGTAACTCGCTACCTCACCGCGTTGTAACATCGGCTTAGAGAACCAA thing is bigger for being shared.  CAATTCTCCATTTCTTGTTACGTATACACGTAATTCCKnowledge

15、will not be aquired without pain and application.  ATTCTTACAGCGGTTT。根据插入片段我们设计了引物和探针(见表1)。2.2 实时荧光PCR检测质粒标准品 梯度稀释质粒模板进行实时荧光PCR检测时显示，靶基因扩增反应的Ct值和模板之间均存在良好的相关性，相关性为1.0，扩增效率达到0.97。见图1。What I have done is due to patient thought.  2.3 不同浓度质粒标准品的重复性检测 高中低三个浓度的质粒标准品5次重复性实验,

16、60;高中值稳定，低浓度波动相对较大，定量结果的数值取以10为底的对数，高浓度质粒变化量极差为0.08个数量级;中浓度质粒变化量极差为0.04个数量级;低浓度质粒变化量极差为0.19个数量级(见表2)。表1 引物及探针序列表2 不同浓度质粒DNA标本检测稳定性(A)1：模板量为 5.0 × 108拷贝每反应体系的质粒 DNA;2：模板量为 5.0 × 106拷贝每反应体系的质粒 DNA;3：模板量为 5.0×104拷贝每反应体系的质粒 DNA;4

17、：模板量为 5.0×102拷贝每反应体系的质粒 DNA;(B)质粒标准品拷贝数对数值与CT值的相关性2.4 冻融次数对质粒标准品的影响 高中低三个浓度的质粒标准品反复冻融1次，6次，11次，16次和21次后，进行实时定量PCR检测，结果显示，反复冻融21次以内，高中值稳定，低浓度波动相对较大，定量结果的数值取以10为底的对数，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级，见表3，图2。表3 不同冻融次数对不同浓度质粒DNA标本稳定性的影响图2 实时荧光

18、PCR评价不同冻融次数对标本稳定性的影响One ploughs, another sow; who will reap  (A) 1：模板量为 5.0×108拷贝每反应体系的质粒标准品;2：模板量为 5.0×106拷贝每反应体系的质粒 DNA;3：模板量为 5.0×104拷贝每反应体系的质粒 DNA;4：模板量为 5.0×102拷贝每反应体系的质粒 DNAA thing is bigger for being shared.  3 讨论基因扩增技术的发展使对微生物病原体的定性或定量检测的能力随之提高，以基因扩增为基础的Real-time PCR技术是主要用于科研和诊断领域的检测方法9，10。标准品是荧光定量PCR的必需前提，定量标准品的微小变化，会直接影响定量结果。Real-time PCR定量用的标准品通常是重组