土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化

1、第24卷 第3期沈 阳 化 工 大 学 学 报JOURNALOFSHENYANGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGY2010.09Vo.l24 No.3Sep.2010文章编号: 1004-4639(2010)03-0203-06土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化雷晓燕(沈阳化工大学环境与生物工程学院,辽宁沈阳110142)摘 要: 为筛选淀粉酶的高产菌株,利用淀粉水解圈作为筛选模型,从淀粉厂附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌B5.对其产酶条件进行优化,最终得到最佳碳源为质量分数为2 0%的淀粉,最佳氮源为质量分数为0 5%的酵母膏加质量分数为0 5%的蛋白胨

2、,最适初始pH值为6 0,最适培养温度为37 ,最适溶氧量为50mL摇瓶装15mL培养基,最佳产酶时间为48h,培养基中同时补充质量分数为0 05%的MgSO4、质量分数为0 05%的CaCl2和质量分数为0 005%的FeSO4时可大幅提高酶活力.菌株B5液体发酵产酶活力最高可达158 89U/g,该淀粉酶最适反应温度为42 ,最适反应pH值为5 0.关键词: 淀粉酶; 水解圈; 酶活力中图分类号: Q939 9 文献标识码: A淀粉酶(Amylase)是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中,是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种1但适合商业生产需要的

3、菌株仍然很少,在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件.本文以土壤作为原料,从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行产酶条件的考察和优化,进一步提高其产酶能力,为使其最终能应用于工业生产、带来经济效益做大量的准备工作.特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化,淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50%以上2.淀粉酶根据其作用方式可分为 淀粉酶(EC3 2 1 1)与 淀粉酶(EC3 2 1 2). 淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中31 实验材料与方法1 1 材 料1 1

4、1 菌种细菌B5,由沈阳某淀粉厂附近土壤中筛选得到.1 1 2 培养基(1)斜面培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;KNO3,质量分数0 1%;琼脂,质量分数2 0%;水100mL;pH值6 0.(2)分离平板培养基:可溶性淀粉,质量分.微生物的许多种类都能产生淀粉酶,Buchanan和Tamuri等人描述了数百种嗜热真菌和上千种细菌可产生淀粉酶,仅Bacillus属48个种中就有32个种能产生 淀粉酶.淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理

5、、青贮饲料及微生态制剂等多种领域54.因为淀粉酶的用途广泛,各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研6-8究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260U/mL左右.虽然不少微生物能产生淀粉酶,收稿日期: 2009-02-09作者简介: 雷晓燕(1972-),女,陕西绥德人,讲师,硕士,主要从事生物技术教学和科研工作.204沈 阳 化 工 大 学 学 报 2010年数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;琼脂,质量分数2 0%;水100mL;pH值6 0.(3)种子培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;酵母膏,

6、质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;水100mL;pH值6 0.(4)产酶液体培养基:可溶性淀粉,质量分数2 0%;酵母膏,质量分数0 5%;蛋白胨,质量分数0 5%;NaC,l质量分数0 5%;KH2PO4,质量分数0 1%;CaCl2 2H2O,质量分数0 05%;MgSO4 7H2O,质量分数0 05%;FeSO4 7H2O,质量分数0 005%;水100mL;pH值6 0.1 1 3 主要试剂培养基成分为市售分析纯和生化试剂.1 1 4 主要仪器DHP 420电热恒温培养箱(光明医疗仪器厂),LDZX 40B!型立式自

7、动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),ZD 85气浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司),WD900微波炉(顺德市格蓝仕电器实业有限公司),HNP 1水平流形超净工作台(南通沪南科学仪器有限公司),101 2A型数显式电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司),FA1104分析天平(上海精科天平有限公司),BC/BD 428A卧式冷藏冷冻转换柜(青岛海尔特种电冰柜有限公司),SP 2000722型可见分光光度计(上海莱奥光学仪器有限公司).1 2 方法1 2 1 菌种筛选初筛:从沈阳某淀粉厂附近采集土样,称取5g土样,放入装有45mL无菌水的三角瓶中,震荡20min后静置5min,然后进行

8、浓度梯度稀释-6-4-5-6到10,分别在10、10、10浓度下各取1mL土壤稀释液制成混菌平板,将培养皿放入37 培养箱中培养24h.取出培养好的平皿,在长出的菌落上滴加碘液,菌落周围如有无色透明圈出现,说明淀粉被水解,即该菌株能产生淀粉酶,编号保存.复筛:从冰箱中取出所有初筛得到的菌株,转接试管斜面活化,37 下恒温培养24h.将所有菌种分别点种到分离培养基平板上进行培养,待菌落长成后向菌落上滴加碘液,比较淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0为水解圈直径,d1为菌落直径)较大的菌株连续进行3次平板点种培养,选取d0/d1值最大的菌株作为本实验出发菌株.1 2 2 淀粉酶活力的测定9发酵液4

9、000r/min离心20min,取上清液,即为粗酶液.取5mL质量分数为0 5%的可溶性淀粉溶液,在37 水浴中预热10min,加入适当稀释的酶液0 5mL,准确反应5min后,用5mL浓度为0 1mol/L的HCl终止反应.取0 5mL反应液与5mL稀碘液显色,在620nm处测吸光度.以0 5mL蒸馏水代替0 5mL反应液为空白,以不加酶液(加同体积的缓冲液)的管为对照.酶活定义:在37 、pH=6 0条件下,5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位.酶活力根据以下公式计算:酶活=(R0-R)/R050D4.式中,R0、R分别表示对照和反应液的光密度,D为粗酶液的稀释倍数.调整D使(R0

10、-R)/R在0 20 7之间,4为转换系数,无单位.1 2 3 最佳碳源的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,于24h后分别取1mL培养液,加入到2 0%淀粉,2 0%麦芽糖,2 0%乳糖,2 0%蔗糖,2 0%葡萄糖5种不同碳源的产酶培养基中,于37 摇床培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳碳源.1 2 4 最佳氮源的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,于24h后分别取1mL培养液,加入到氮源分别为0 5%(质量分数,下同)牛肉膏,0 5%酵母膏,0 5%蛋白胨,0 5%牛肉膏+0 5%蛋白胨,0 5%酵母膏+0 5%蛋白

11、胨5种不同氮源的产酶培养基中.于37 摇床培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳氮源.第3期 雷晓燕:土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化 2051 2 5 最佳培养基初始pH值的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,加入到pH值分别为5 0、6 0、7 0、8 0、9 0,碳源和氮源已优化的产酶培养基中,37 下培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳培养基的初始pH值.1 2 6 最佳培养温度的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,加入

12、碳源、氮源和pH值已优化的产酶培养基中,分别于33 、35 、37 、39 、41 下培养48h.分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳培养温度.1 2 7 最佳溶氧量的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,接入已优化碳源、氮源和pH值的产酶培养基中培养,产酶培养基的装液量分别为10mL、15mL、20mL、25mL、30mL,37 下培养48h,分别离心收集粗酶液,测定其淀粉酶活力,根据所测定的结果确定最佳溶氧量.1 2 8 最佳产酶时间的确定取出发菌株活化,然后取一环接入种子培养基中培养,24h后分别取1mL培养液,接入已优

13、化碳源、氮源和pH值的产酶培养基中培养,分别于0h,12h,24h,36h,48h,60h取样,测定发酵液的酶活力,根据所测定的结果确定最佳产酶时间.1 2 9 离子对产酶的影响通过向培养基中添加质量分数为0 05%的MgSO4、质量分数为0 05%的CaCl2和质量分数为0 005%的FeSO4等不同离子进行产酶实验,培养48h,测定酶活力,根据测定结果确定最适添加的离子.1 2 10 酶反应最适pH值的确定分别用pH值为4 0、5 0、6 0、7 0、8 0、9 0的缓冲溶液配制可溶性淀粉液,将在最适条件下培养获得的粗酶液分别在以上各种pH值条件下测定其淀粉酶活力,根据所测得的结果确定淀粉

14、酶反应的最适pH值.1 2 11 酶反应最适温度的确定将在最适条件下培养获得的粗酶液分别在27 、32 、37 、42 、47 、52 等各种不同温度下测定淀粉酶活力,根据所测得的结果确定淀粉酶反应的最适温度.2 实验结果2 1 初筛结果土样经稀释并在淀粉培养基平板上培养后,共挑选出24株能水解淀粉的细菌,分别将24株细菌接种到斜面培养基上,编号为B1B24,菌株产生水解圈的情况如图1所示.图1 淀粉酶产生菌产生的淀粉水解圈Fig.1 Hydrolysiscircleofstarchproducedbyastrainwhichcanproduceamylase2 2 复筛结果将所有初筛得到的菌

15、种分别点种到淀粉培养基平板上进行培养,待菌落长成后向菌落上滴加碘液,比较淀粉水解圈大小,挑取d0/d1(d0为水解圈直径,d1为菌落直径)较大的5株菌株连续进行3次平板点种培养,最终选取d0/d1值最大的菌株B5作为本实验出发菌株.将B5菌株接多支斜面,经培养后于低温保存.复筛结果见表1.表1 复筛结果Table1 Resultsofre screening编号12345水解圈直径d0/cm2 402 901 701 901 90菌落直径d1/cm1 301 801 001 200 60d0/d11 851 611 701 583 17206沈 阳 化 工 大 学 学 报 2010年2 3菌株

16、产酶条件的优化发酵过程中影响菌株生长、产酶的主要因素为:碳源、氮源、发酵培养基的初始pH值、发酵温度、溶氧量、金属离子及产酶时间.对上述因素进行全面考察,以确定菌株的最佳产酶条件.2.3.1 碳源对细菌B5产酶能力的影响分别在5种含不同碳源的发酵培养基中培养细菌B5,37 摇床培养48h.经过对发酵液中淀粉酶活力的测定,可知碳源为质量分数为2 0%的淀粉时细菌B5产酶活力最高,测定结果见图2.37 下培养48h,测定不同pH值下淀粉酶活力,结果见图4,根据所测定的结果确定最佳培养基的初始pH值为6 0.图4 培养基初始pH值对菌株B5产酶能力的影响Fig.4 Theimpactofinitia

17、lpHonBacteriumB5inproducingamylase2 3 4 培养温度对菌株B5产酶能力的影响将出发菌株B5分别在5种不同温度下进行培养,48h后离心收集粗酶液,测定淀粉酶活力,结果见图5.由图5结果可以看出,37 培养时菌株B5产酶能力最强.图2 碳源对细菌B5产酶的影响Fig.2 TheimpactofcarbonsourceonBacteriumB5inproducingamylase2 3 2 氮源对细菌B5产酶能力的影响分别在含5种不同氮源的发酵培养基中培养细菌B5,37 摇床培养48h.经过对发酵液中淀粉酶活力的测定,可知氮源为质量分数0 5%酵母膏+质量分数0

18、5%蛋白胨时细菌B5产酶活力最高,测定结果见图3.图5 培养温度对菌株B5产酶能力的影响Fig.5 TheimpactofculturetemperatureonBacteriumB5inproducingamylase2 3 5 溶氧量对菌株B5产酶能力的影响将菌株B5在不同溶氧情况下进行培养,48h后离心收集粗酶液,测定淀粉酶活力,结果见图6.由图6可以看出,50mL摇瓶中装液量为15mL时为最佳溶氧量.图3 氮源对菌株B5产酶能力的影响Fig.3 TheimpactofnitrogensourceonBacteriumB5inproducingamylase图6 溶氧对菌株B5产酶能力的

19、影响Fig.6 TheimpactofdissolvedoxygenonBacteriumB5inproducingamylase2 3 3 培养基初始pH值对菌株B5产酶能力的影响将碳源和氮源已优化的产酶培养基pH值7892 3 6 最佳产酶时间的确定B5在不第3期 雷晓燕:土壤中淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化 207同时间点取样测定酶活力,结果如图7所示.由图7可见以看出,菌株B5的最佳产酶时间是48h.由图9可以看出,pH值为5 0时淀粉酶活力最强.2 4 2 酶反应最适温度的确定分别在各种不同温度下测定菌株B5所产淀粉酶的酶活力,结果见图10.由图10可以看出,在42 时酶活力最强,

20、此时酶活力可达158 9U/mL.图7 菌株B5淀粉酶最佳产生时间的确定结果Fig.7 ThedeterminationofoptimaltimeinproducingamylasebyBacteriumB52 3 7 离子对产酶的影响2+2+2+Mg、Ca、Fe是很多种酶的激活剂并且可以提高酶活力,为测定这几种离子对菌株B5所产淀粉酶是否有提高酶活力的作用,向培养基中单一或混合添加几种离子进行发酵产酶实验,酶活测定结果见图8.由图8可以看出,同时添加3种离子对菌株B5产酶能力有较大的影响.图10 酶反应最适温度的测定结果Fig.10 Thedeterminationofoptimalreac

21、tiontemperatureofamylase在最适条件下菌株B5所产淀粉酶活力从最初的92 6U/mL提高到158 9U/mL,酶活力提高效果明显.3 结 论实验中筛选出的细菌B5具有产淀粉酶的能力,菌株产酶能力通常会受到菌株培养时碳源、氮源、培养基初始pH值、培养温度、溶氧、离子等许多因素的影响,另外菌株所产酶的活力也图8 离子对菌株B5产酶的影响Fig.8 TheimpactofiononBacteriumB5inproducingamylase会受到酶发挥作用时最适温度和最适pH值的影响.综合考察以上各种影响因素对酶活力的影响后,确定菌株B5产淀粉酶的最适培养条件以及淀粉酶发挥作用时

22、的最适条件.以淀粉厂附近土样为原料,通过淀粉水解圈筛选模型筛选得到一株产淀粉酶活力较强的细菌B5.通过对B5产酶条件的考察得出:培养基中最佳碳源为质量分数2%的淀粉,最佳氮源为质量分数0 5%的酵母膏加质量分数0 5%的蛋白胨,最适初始pH值为6 0,最适培养温度为37 ,最适溶氧量为50mL摇瓶装15mL培养基,最佳产酶时间是48h,培养基中同时补充质量分数0 05%的MgSO4、质量分数0 05%的CaCl2和质量分数0 005%的FeSO4时可大幅提高酶活力.该淀粉酶最适反应温度为42 ,最适反应pH值为5 0.菌株B5液2 4 菌株B5所产淀粉酶酶学性质的研究2 4 1 酶反应最适pH

23、值的确定分别用不同pH值的缓冲溶液配制可溶性淀粉液,测定淀粉酶活力,结果见图9.图9 酶反应最适pH值的确定结果Fig.9 ThedeterminationofoptmialreactionpHofamylase体发酵产酶活力最高可达158 9U/mL,该菌株如果再进一步进行诱变处理酶活力还有提升空208沈 阳 化 工 大 学 学 报 2010年6 ShojiH,SugimotoT,HosoiK,eta.lSimultaneous间.本实验方法简便、直观,可快速、高效地筛选出淀粉酶产生菌.ProductionofGlucoamylaseandAcidStable am ylaseUsingNo

24、velSubmergedCultureofAspergillusKawachiiNBRC4308J.JournalofBioscienceandBioengineering,2007,103(2):203-205.7 NagamineK,MurashimaK,KatoT,eta.lModeofamylaseProductionbytheShochuKojiMoldAs pergillusKawachiiJ.Bioscience,BiotechnologyandBiochemistry,2003,67(10):2194-2202.8 SivaramakrishnanS,GangadharanD,

25、NampoothiriKM,eta.l AmylasefromMicrobialSources#AnOverviewonRecentDevelopmentsJ.FoodTech nolBiotechno,l2006,44(2):173-184.9 沈萍.微生物学M.2版.北京:高等教育出版社,2002:63-65.参考文献:1 谷军. 淀粉酶的生产与应用J.生物技术,1994,4(3):1-5.2 白坤,于德贵,周冬颖. 淀粉酶的性质及其液化作用J.中国酿造,1995(5):1-5.3 张强,刘成君,蒋芳,等.耐高温 淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶性质研究J.食品与发酵工业,2005,3

26、1(2):34-37.4 罗志刚,杨景峰,罗发兴. 淀粉酶的性质及应用J.食品研究与研发,2007,28(8):1-18.5 张丽苹,徐岩,金建中.酸性 淀粉酶的研究与应用J.酿酒,2002,29(3):4-15.ScreeningofBacteriumProducingAmylasefromtheSoilandOptmiizationoftheConditionforEnzymeProductionLEIXiao yan(ShenyangUniversityofChemicalTechnology,Shenyang110142,China)Abstrac:t Inordertoscreenabacteriumw