实验五 DNA的回收与连接

1、实验五 DNA的回收与连接实验目的1 掌握DNA连接的的方式和影响连接反应的因素。2 学会DNA回收和连接技术。实验原理T4-ligase 将载体pUC118 用BamHI + EcoRI酶切，与目的基因1.0kb BamHI + EcoRI片段用T4DNA连接酶连接起来。图5-1 目的DNA与质粒连接示意图实验材料和试剂 （一）实验材料 1 实验二提取的质粒pUC1182 质粒pSYX1，可用BamHI + EcoRI切下1.0kb目的DNA。 （二）试剂 1限制性内切酶BamHI和EcoRI 2l DNA/HindIII分子量标准 3双蒸馏无菌水 4上海生工Silver Beads DNA

2、胶回收试剂盒 5溴酚蓝指示剂点样缓冲液 61mg/ml溴化乙锭溶液 7电泳缓冲液（TAE）8LB培养基9X-gal（20mg/ml）：5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（配制方法：用二甲基甲酰胺溶解X-gal，配制成20mg/ml的贮存液。防止光照破坏，-20保存）10IPTG（20mg/ml）：异丙基硫代-b-D-半乳糖苷（配制方法：用蒸馏水配制成20mg/ml的贮存液，-20保存） （三）器材1.5ml Eppendorf管 200ml吸头 90mm培养皿 1ml移液管 手术刀片 三角爬 （四）仪器 微量移液器 离心机 恒温水浴锅 电泳仪 水平电泳槽 透射紫外观察仪实验步骤（一）

3、载体的线性化和制备目的基因片段 1. 取一个灭菌的Eppendorf管，依此加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 11ml 10缓冲液 2ml 质粒pUC118 5ml BamHI 1ml EcoRI 1ml 总体积 20ml 2. 取一个灭菌的Eppendorf管，依此加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 11ml 10缓冲液 2ml pSYX1 5ml BamHI 1ml EcoRI 1ml 总体积 20ml3用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。 4. 置37水浴60120 分钟。5. 加入5ml溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果，鉴定酶切效果。 6用干净的手术刀

4、从琼脂糖凝胶中分别割下含有3.2 kb DNA条带（pUC118）和1.0kb DNA条带（目的DNA）的琼脂块，各自放入灭菌的Eppendorf管中。 7按每l00mg琼脂糖凝胶中加入400ml Solubization Solution和10ml Silver Beads（使用前充分混匀），5060水浴中10分钟，使胶彻底融化，溶胶过程每两分钟混匀一次。 810,000r/min高速离心l分钟，小心吸掉上清。 9用500ml Wash Solution将Silver Beads悬浮起来，10,000r/min高速离心l分钟。 10小心吸掉上清，用500ml Wash Solution将Si

5、lver Beads悬浮起来，10,000r/min高速离心1分钟。11小心吸掉上清，Eppendorf管倒置，室温干燥10分钟，不要使Beads完全干燥。 12用20ml Elution Buffer或水（pH7.0）将Silver Beads悬浮起来，室温或37放置510分钟。中途混匀若干次。 1310,000r/min高速离心1分钟，小心将洗脱液移到灭菌的Eppendorf管中，注意不要吸取Beads。 1410,000r/min高速离心1分钟，除去洗脱被中可能存在的微量的Beads。 （二）连接反应 1取一个灭菌的Eppendorf管，依此加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 8ml 10连接酶缓冲液 2ml pUC118/BamHI 3ml 目的DNA 6ml T4DNA连接酶 1ml 总体积 20ml 2用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。 3. 置16水浴1216小时。4. 将连接反应液转化大肠杆菌DH-5a感受态细胞（具体方法见实验一）。 5制备含氨苄青霉素的LB平板，于平板表面加40ml X-gal和40ml IPTG，并用无菌三角爬将试剂均匀涂布于整个平板表面。6取200ml转化的菌液涂布于平板表面， 37倒置平板培养2024小时。 7观察平板上长出的菌落，蓝色菌落为载体自连转化子，白色菌落为重组DNA转化子。 8挑取