HBVS基因与IL-12基因联合免疫小鼠的免疫应答.

1、HBVS基因与IL-12基因联合免疫小鼠的免疫应答HBV S 基因与 IL-12 基因联合免疫小鼠的免疫应答第四军医大学学报 2000 年第 21 卷第 4 期王全楚周永兴姚志强冯志华摘 要：目的 观察小鼠对 IL-12 基因表达质粒与 HBV s 基因疫苗联合免疫 的免疫应答方法 用已构建的 HBV s 基因疫苗（pCR3.1-S）和表达 IL-12 p35 和 p40 蛋白的真核表达载体 pW rG3169 分别给 BALB/c 小鼠多点肌肉注射， 2 wk 后追加免疫 1次，用 ELISA 法及 MTT 法检测小鼠 血清抗-HBs 及脾细胞对 HBsAg 的特异性增殖反应.结果 免疫接种

2、 2 wk 后小鼠 血清抗-HBs 滴度 及脾 细胞对 HBsAg 的刺激指数均明显高于对照组，pWRG3169+pCR3.1 组明显高于 单纯 pCR3.1-S 注射组.结论 IL-12表达质粒可以增强 pCR3.1-S 基因疫苗诱导 的体液和细胞免疫应答强度；尤以细胞免疫增高明显关键词：肝炎病毒，乙型；基因免疫；IL-120 引言基因免疫是近几年发展起来的新的生物技术，不仅可诱导体液免疫应答，而且可诱导强烈而 持久的细胞免疫应答：1：.细胞因子可通过不同作用环节调节 和增强 DNA的免疫效应，发挥免 疫佐剂作用.IL-12 在机体免疫功能中具有重 要作用，尤其 是对Th1/Th2 平衡的影

3、响备受关注 .为探求 HBVS因免疫的 增强策略，我们对 IL-12 基因表达质粒与 HBV S 基因联合免疫的小鼠细胞和体 液免疫应答进行了研究 .1 材料和方法1.1 材料 编码 IL-12 p35 和 p40 蛋白的真核表达载体 pWR G316 抽美国 Rakhmilevich 博士惠赠:3.含 HBV S 基因的质粒 pCR3.1-S 由姚志强教授在 比 利时鲁汶大学构建：以计算机设计 PCR 引物，从 HBV 患者血清（adw 型）中获 得 HBV s基因序列，以 T-A 克隆法插入真核表达载体 pCR3.1 （Invitrogen 公 司产品），酶切、电泳，鉴定正向插入片段，最后

4、得到重组质粒PCR3.1-S.质粒的大量制备以两种质粒分别转化感受态大肠杆菌 JM1 09（本室保存），筛选 阳性克隆，经 LB 培养基扩增，按碱裂解法提取质粒，聚乙二醇（PEG 法纯 化，通过紫外分光光度计测定其浓度，按 1 g*L-1溶于无菌生理盐水中，-20E储存备用 .1.2 方法 选用 68 wk 龄雌性 BALB/c 小鼠（本校实验动物中心提供），随机分为 3 组，S 基因对照组（每次注射 pCR3.1-S 100 卩 g）、增强组（每次注射 pCR3.1-S 和 pWRG316 各 100 卩 g） 、 对照组 （每次注射空载体 PCR3.1100 卩 g），每组小鼠 5 只.注

5、射前以 2.5 g*L-1盐酸布比卡因 100 卩 g 预处理小鼠股四头肌， 24 h 后将相应质 粒直接多点注射处理后肌肉，间隔 2 wk 后追加免疫 1 次.不同时间间隔剪尾取血.免疫 4 wk 后， 处死小鼠， 取小鼠 脾细胞， 洗涤后用含 100 mL*L-1胎牛血清的 RPMI 1 640 培养液重悬， 制成细胞 悬液浓度为 1X109*L-1， 加入 96 孔板，每孔100卩g,平行3孔， 前2孔分别 加入HBsAg 5卩g/孔和1 : 300植物血凝素 （PHA，第 3 孔只加 buffer，作对-1照.37 C ,50 mL*L CO2 温育 72 h，加入四甲基偶氮唑盐（MT

6、 t） 10 卩 g， 37C继续孵 育 4 h，弃去孔内培养液，每孔加入 DMSO150L,振荡 10 min， 使结晶物充分溶解，在酶免疫检测仪上测各孔 A490 nm 计算刺激指数（SI）， SI=实验孔 A490 nm/对照孔 A490 nm.抗-HBs 抗体检测：在 HBsAg 包被好的 96 孔 ELISA 软板（华美生物技术公司）中加入生理盐水稀释过的小鼠血清（1 : 50），37C孵育 1 h，洗涤后加入 HRP 标记羊抗鼠 IgG，洗涤，加 TMB 为 底物，于波长 450 nm 处测 ELlSA A490 nm. （ELISA 仪系 Bio-Rad 公司产 品），以检测 A

7、490 nm/阴性对照 A490 nm =2.1 为阳性.2 结果以 Xbal 酶切重组质粒 pCR3.1-S,获得 630 bp 片段，结果符合酶切图谱2.1T 细胞抗原特异性增殖反应增强组除对 HBsAg 表现出特异性增殖反应外，IL-12 也对 PHA 有非特异性增殖反应（Tab1）.表 1 小鼠脾细胞对 HBsAg 增殖反应的刺激指数tab 1Stimulatory in dex of sple no cytes on HBsAgSIGroupHBsAgPHApCR3.1-S+pWRG31691.9 0.6ac1.5 0.2ac(n=5,X s)1.4 0.3a1.2 0.1cpCR3

8、.1-SpCR3.10.9 0.11.0 0.1aPv0.05 vs pCR3.1,cPv0.05 vs pCR3.1-S group. 22小鼠血清抗-HBs-IgG 2 wk 后实 验组和增 强组均产生了抗-HBs 特异性抗体.免疫 4 wk 后增强 组抗-HBs效价高于实验组(Pv0.05,Fig 1).图 1 重组质粒免疫小鼠血清的抗 HBs 效价fig 1Serum antiHBs titers of mice immunized with pCR3.1-S, pWRG3169 plus pCR3.1-S or pCR3.13 讨论IL-12 是目前认为的作用免疫细胞范围最广、作用最

9、强的细胞素.它对免疫应答的调节是通过促进 Th1 细胞的形成及分泌细胞因子而刺激 T 细胞的分化 增殖，促进 CTL,LAK 细胞等的形成，从而增强机体对病原体的杀伤及清除作用.我们的实验结果表明，编码 IL-12 的表达质粒 可以提高 pCR3.1-S 诱导的体液 和细胞免疫强度，尤以后者为甚.这与 Chow 等”报 告的结果 一致，但与 Kim 研究结论相反产生这种差异的原因还不清楚，可能与重组表达载体在体内转染细胞类型不同及 IL-12 在体内的表达量和生物活性不同有关.chow将 5 种 含细胞因子编码基因的重组表达载体 （pIL-12 pIL-4,pIL-2,pIFN-r,pGM-

10、CSF 分别与含 HBsAg编码基因的 重组表达载体一起肌注小鼠，发现 5 种细胞 因子的重组表达载体均使抗-HBs 的 IgG 抗体产生增加（pIFN-R 除外）.Kim 等：句将 IL-12 基因生编码人类免疫缺陷病毒 1 抗原的基因一同免疫 动物，发现 特异性抗体应答降低，而 T 细胞增殖反应和抗原特异性细胞毒活性明显增强.这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防乙型肝炎病毒感染具有保护作用，而且 对慢性病毒感染具有治疗和清除作用 MacGregor 等率先将基因疫苗用于 艾 滋病的临床治疗，15 例无症状 AIDS 患者均产生特异性体液免疫，部分表现出 较强的 CTL 反应和淋巴细胞增殖活性

11、.如何充 分利用 IL-12 的细胞免疫增强作 用，将基因免疫过渡到慢性乙型肝炎患者的临床治疗，将是今后努力的一个方 向基金项目：国家自然科学基金资助项目（39770065）作者简介:王全楚（1966-）,男（汉族）,湖北省云梦县人.主治医师,硕士,已发表论文 30 篇.现工作单位：河南郑州 153 医院传染科.tel.（ 029）3577595 王 全楚（第四军医大学唐都医院传染科，陕西西安 710038）周永兴（第四军医大学唐都医院传染科，陕西西安 710038）姚志强（第四军医大学唐都医院传染科，陕西 西安 710038）冯志华（第四军医大学唐都医院传染科 ,陕西 西安 710038）参

12、考文献 :1schirmbeck R,Bohm W,Ando K et al. Nucleic acid vaccinati on primeshepatit is B virus surface antigen specific cytotoxic. T Lymphocytes in nonrespondermic e J. j Virol, 1995;69(10):5929- 5934.2Gately MK, Renzetti LM, Magram J et al. The interleukin-12/interleukin-12 receptor system: Role in nor

13、mal and pathologic immuneresponsesJ. annu R ev lmmunol, 1998;16:495-517.3Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ et al. Gene gun-mediate d skintransfec tion with interleukin12 gene results in regression of established primary andme tastic murine tumorsJ . Proc Natl SciuSA,1996;93(13):6291-6296.4Chow YH,

14、Chiang BL, Lee YL et al. Development of Th1 and Th 2populations a nd the nature of immune response to hepatitis B virus DNA vaccine canbe modula ted by codelivery of various cytokine genes J . Jlmmunol,1998;160(3):132 0-1329.5Kim JJ, Ayyavoo V, Bagarazzi ML et al. In vivo engineering of a cellularimmune response by coadministration of IL-12 expression vector with a dNA immunogen J. J Immuno