黄芪注射液对basallike型乳腺癌细胞MDAMB468增殖的影响

1、黄芪注射液对basallike型乳腺癌细胞MDAMB468增殖的影响         09-08-13 15:50:00     作者：叶媚娜, 陈红风    编辑：studa20【摘要】  目的：观察黄芪对basallike乳腺癌细胞MDAMB468和小鼠骨髓基质干细胞（murine bone marrow stromal stem cells, mMSCs）增殖的影响及其异同。方法：用不同浓度的黄芪注射液（Astragal

2、us injection, AI）分别干预MDAMB468和mMSCs，不加AI培养2 d的MDAMB468细胞作为空白对照。用相差倒置显微镜观察细胞形态，透射电子显微镜观察细胞超微结构。运用细胞计数试剂盒（cell counting kit8, CCK8）检测AI对MDAMB468的细胞毒性作用。流式细胞术检测AI对细胞周期和细胞凋亡的影响。酶比色法监测 MDAMB468细胞培养上清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）含量。免疫细胞化学法检测AI对MDAMB468表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和p

3、53蛋白表达的影响。结果：1 g/ml AI对MDAMB468的增殖有明显的抑制作用，且具有时效关系。1 g/ml AI对mMSCs的增殖有明显的抑制作用，但其抑制作用不及顺铂，而0.1 g/ml AI对mMSCs的增殖有明显的促进作用。不同浓度的AI能诱导MDAMB468细胞凋亡。不同浓度AI组和顺铂组MDAMB468细胞培养上清LDH水平，与空白对照组相比，差异均无统计学意义。AI能显著下调EGFR和p53蛋白的表达。结论：AI对MDAMB468和mMSCs增殖的影响与药物浓度有关，其抑制MDAMB468增殖和诱导凋亡的机制可能通过下调EGFR和p53蛋白的表达而实现。 【关键词】

4、0; 黄芪注射液; 乳腺癌; MDAMB468细胞; 细胞增殖; 小鼠Objective: To investigate the effects of Astragalus injection (AI) on basallike breast cancer cell line MDAMB468 and murine bone marrow stromal stem cells (mMSCs).Methods: MDAMB468 cells and primary cultured mMSCs were treated by different concentrations of AI, and

5、 with untreated MDAMB468 cells as blank control. The morphology of cells was observed by phasecontrast inverted microscope and transmission electron microscopy. Cytotoxic effects of AI on MDAMB468 cells and mMSCs were evaluated by cell counting kit8 (CCK8) assay. Cell cycle and apoptosis of MDAMB468

6、 cells induced by AI were measured by flow cytometry. Lactate dehydrogenase (LDH) activity in supernatants was measured by enzymatic colorimetric method. The expressions of epidermal growth factor receptor (EGFR) and p53 protein in MDAMB468 cells were evaluated by streptavidinbiotinperoxidase comple

7、x method.Results: A timedependent cytotoxic effect of 1 g/ml AI was observed in MDAMB468 cells. 1 g/ml AI also had cytotoxic effect on mMSCs, but its effect was not better than cisplatin. 0.1 g/ml AI could promote the proliferation of mMSCs. Different concentrations of AI could all induce the apopto

8、sis of MDAMB468 cells. There was no significant difference in LDH activity in the supernatants between blank control group and AItreated and cisplatintreated groups. AI could downregulate the expressions of EGFR and p53 protein.Conclusion: The effects of AI on MDAMB468 cells and mMSCs are related to

9、 the concentration of AI, and its mechanism of inhibiting the proliferation of MDAMB468 cells may be due to downregulation of the expressions of EGFR and p53 protein.Keywords: Astragalus injection; breast cancer; MDAMB468 cells; cell proliferation; mice    乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤，在我国的发病率持续上

10、升，尤其北京、上海等大城市女性乳腺癌发病率已列居女性恶性肿瘤发病率首位，并呈现出发病年龄年轻化的趋势1。根据雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progestin receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor2, HER2）的表达，国际上将乳腺癌划分为luminal A、luminal B、HER2过表达、basallike和normal breastlike等亚型2，3。其中basallike型乳腺癌短期内容易发生远处转移，生存期较短，患者年龄偏低，除手术和放化疗外，不适合使用

11、内分泌治疗，也无其他有效的治疗手段4，这已成为目前临床治疗的难点和研究的热点。因此，中医药干预在该亚型乳腺癌的综合治疗中就显得尤为重要。本实验通过观察黄芪对basallike乳腺癌细胞MDAMB468的增殖、细胞周期和凋亡以及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和p53蛋白表达的影响，探讨其作用机制。1  材料与方法1.1  实验材料1.1.1  细胞株 Basallike型乳腺癌细胞株MDAMB468购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。1.1.2  药物及试剂

12、 黄芪注射液（Astragalus injection, AI）（批号：0611121），10 ml/支，每支相当于含生药20 g，购自正大青春宝药业有限公司；顺铂注射液（批号：S081881），1 mg/ml，购自澳大利亚F. H. Faulding & Co. Ltd. Trading as David Bull；胎牛血清（批号：560553）、L15培养基（批号：1300873）和McCoys 5A培养液（批号：1329702）均购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit8, CCK8）（批号：VX749）购自日本同仁化学研究所；p53抗

13、体（批号：200703）和EGFR抗体（批号：200703）均购自武汉博士德生物工程有限公司；二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）底物试剂盒（批号：200608）购自上海长岛生物技术有限公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）检测试剂盒（批号：68363901）购自中国罗氏公司；Triton X100、碘化丙啶（propidium iodide, PI）、RNase酶由上海肿瘤医院乳腺实验室流式细胞室提供。1.1.3  实验仪器及设备 CO2培养箱（Heraeus），荧光倒置显微镜（Olympus），超净工作台（苏净集团

14、），Thermo Labsystems Multiskan MK3全自动酶标仪，Facscalibour流式细胞仪（BD Bioscience）、Philips CM120透射电子显微镜和日立7170s全自动生化分析装置。1.2  实验方法1.2.1  CCK8法检测AI干预MDAMB468细胞的量效和时效关系  取对数生长状态良好的MDAMB468细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×104/ml，以每孔5×103的量接种于96孔板，待细胞生长基本融合后加入AI，使其终浓度分别达到含生药量1 g/ml、0.1 g/ml和0.01 g/m

15、l。同时另设调零孔和阴性对照孔。每组设5个复孔。于作用2 d后，每孔加培养液100 l、CCK8溶液10 l，37 孵育2 h。应用MK3酶标仪，于波长450 nm处测得每孔的吸光度（absorbance, A），检测量效关系。另以AI终浓度分别为1 g/ml和0.1 g/ml含药培养液作用1、2、3、4、5、6和7 d时测定每孔的A值，隔日更换培养液。检测时效关系。1.2.2  透射电子显微镜下观察MDAMB468细胞超微结构 取对数生长期细胞，将终浓度为1 g/ml和0.1 g/ml的AI作用细胞2 d后，用细胞刮刀刮下细胞后，收集细胞，2 000 r/min离心15 min，弃上清，缓缓加入4 预冷的2%戊二醛固定1 h。1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，制成50 nm超薄切片，经3%醋酸铀枸橼酸铅双染色后在透射电子显微镜下进行观察。以不加AI培养2 d的MDAMB468细胞作为空白对照。1.2.3  流式细胞术检测MDAMB468的细胞周期和凋亡  取对数生长期细胞，将终浓度为1 g/ml和0.1 g/ml的AI作用细胞2 d后，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，1