DNA胶回收常见问题

1、 DNA胶回收中常见问题分析 DNA胶回收中常见问题分析1、如何计算提取率？1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率；2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比；3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。2、如何简易测算提取率？ 取胶回收后的DNA溶液体积的1/51/10，与等体积的回收前的DNA溶液的510倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率（如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%）。

2、 3、如何看待提取得率？影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。 4、回收率为什么与点样量和片段大小有关？DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因？1） 胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例；2） 胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则

3、先将其切为小块，分多次回收；3） 紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内；4） 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率；5） TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好。6） 回收前的样品量太少，加大点样量7） 洗脱前，预先65预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？ 1） 胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶； 2

4、） 胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收； 3） 水浴温度是否达到规定温度65，用温度计检测。7、琼脂糖凝胶块不溶？ 1） 琼脂糖质量不好; 2） 含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 或-20； 3） 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。8、点样时发现DNA样品有漂出点样孔外的现象？柱子上的乙醇未完全挥发干净，延长室温下空柱静置时间以确保乙醇完全挥发干净。9、能否使用去离子水洗脱回收？可以，但是实验室所用去离子水一般PH值偏低，可用NaOH适当调高PH值7.0，以增加回收得率。10、能否使用TE（PH8.0）洗脱？可以

5、11、可否使用小于30l的洗脱液进行洗脱？不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。12、关于DNA片段大小与回收率的问题？ 100bp-500bp，30-60%；500bp-4kb，80-95%；4kb以上，30-50%。13、OD值与琼脂糖凝胶中的DNA产量不相符？从柱子上洗脱下来的痕量杂质增加了A260的值14、吸光度纯度测定时应注意的问题吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度，所以请用与洗脱液体相同的液体，对测量样品进行稀释和调零。15、为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度？在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密的结合在一起，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解，DNA才能充分释放，否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。 广州市珀尔生物科技开发有限公司生产地址：深圳市龙岗区龙坪西路