NO参与AngⅡ诱导心肌成纤维细胞胶原含量的变化

1、NO参与Ang诱导心肌成纤维细胞胶原含量的变化         11-02-13 13:17:00     编辑：studa20                      作者：周有华， 王杨，董战玲 ，符史干【摘要】  目的：探讨NO前体LArg和NOS抑制

2、剂LNAME在血管紧张素诱导CFs胶原合成中的作用。方法： 用胰酶消化法分离、纯化、培养新生SD大鼠CFs, 采用CFs羟脯氨酸含量测定、以羟脯氨酸标准曲线求出样本中羟脯氨酸含量，胶原含量以羟脯氨酸含量×7.4表示。结果：(1)在培养液中加入Ang109105 mol/L，CFs胶原含量呈明显的剂量依赖性;(2)分别给予Saralasin和PTX对CFs胶原含量均无明显影响，但可明显抑制Ang增强CFs胶原含量的作用;(3)预先给予NO前体LArg，再加入Ang，Ang增加CFs胶原含量的效应明显减弱;(4)加入NOS抑制剂LNAME后，再加入LArg和Ang，明显减弱LArg对An

3、g的抑制作用;(5)在用LNAME抑制NOS的基础上，再加入Ang，其Ang促心脏CFs的作用进一步增强,而单纯应用LNAME对基础状态CFs胶原含量无明显影响。结论：Ang能剂量依赖性增加 CFs胶原含量，此效应是通过Ang受体实现的，可能部分依赖于PTX敏感的G蛋白;NO明显抑制Ang增加CFs胶原含量的作用，CFs内可能存在LArgNO通路，该通路在调控Ang增加CFs胶原含量中有重要作用。 【关键词】  血管紧张素;一氧化氮;心肌成纤维细胞;Saralasin;百日咳毒素;NG硝基左旋精氨酸甲酯       

4、;  ABSTRACT Objective: To investigate the effects of nitric oxide(NO)precursor LArg and NOS inhibitor LNAME on collagen synthesis induced by angiotensin (Ang II) in cardiac fibroblast (CFs). Methods: The CFs of neonatal SD rat were separated, purified and cultured using trypsin digestion method

5、. Hydroxyproline concentration of CFs was determined and calculated by hydroxyproline standard curve, and the collagen concentration was equal to 7.4 times of hydroxyproline concentration. Results: (1) When adding Ang to the culture solution at the dosage of 10-9 10-5 mol / L, collagen concentration

6、 increased in a dosedependent manner. (2) Saralasin and PTX had no significant effects on collagen concentration of CFs; however, they can inhibit Ang from inducing collagen sythesis in CFs. (3) Adding NO precursor LArg before Ang can significantly weaken the inducing effects of Ang in CFs collagen

7、sythesis. (4)The effects of LArg may be inhibited by pretreatment of LNAME, a NOS blocker. (5) The inducing effect of Ang in CFs collagen sythesis was strengthened by NOS blocker LNAME. Conclusions: These results indicate that collagen concentration of CFs can be significantly increased by Ang in a

8、dosedependent manner, which was mediated by Ang receptor and probably may be partially dependent on PTx-sensitive G protein. NO can significantly inhibited Ang form the inducing collagen sythesis. The LArgNO pathway may exist in CFs and probably play an important role in the process of the collagen

9、sythesis induced by Ang .KEY WORDS Angiotensin; Nitric oxide; Cardiac fibroblasts; Saralasin; Pertussis toxin; NGnitroLargingie methyl ester (LNAME)心脏由心肌细胞和以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组成。心肌细胞占心脏总体积的75%，但细胞数仅占心脏细胞总数的1/3，其余2/3为非心肌细胞，包括心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts， CFs)、内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等，其中CFs达

10、90%以上。CFs是心肌细胞外间质改建的主要细胞，虽无收缩功能，但具有增殖能力，可产生和分泌胶原、纤维粘连蛋白等ECM，从而导致心脏间质胶原累积、血液供应障碍及功能(特别是舒张功能)受损。CFs在心脏组织结构及功能的重构中具有重要的作用13，它参与心脏重构(Cardibc remodelling)的3个过程，即心肌细胞肥大、CFs增殖和ECM的累积。一方面，CFs在未受到刺激时具有旁分泌功能，能分泌肥大因子促进心肌细胞肥大4，5;另一方面，某些生长因子如Ang6和去甲肾上腺素7既可促进CFs增殖，也能通过CFs分泌生物活性物质来介导心肌细胞肥大。心肌细胞外间质数量和质量的改变可增加心肌舒张阻力

11、 ,促进组织内电弥散 ,易于发生心律失常、心力衰竭和心性猝死8。新近的研究表明，NO可抑制Ang诱导的CFs增殖和DNA合成速率9。但是Ang对新生大鼠心脏CFs胶原合成及其机制尚未完全清楚，NO在Ang对心脏CFs影响中是否起作用也未完全阐明。本实验通过纯化培养新生大鼠的CFs，检测CFs羟脯氨酸含量的变化，以羟脯氨酸含量×7.4表示CFs胶原含量，探讨NO在Ang诱导心肌成纤维细胞胶原合成中的作用及其机制，为心肌纤维化的发生机制和临床防治提供的实验资料。1 材料与方法1.1 实验动物13 d龄SpragueDawley(SD)大鼠，雌雄不拘，由中山大学医学院实验动物中心提供。1.

12、2 乳鼠心脏成纤维细胞纯化培养1013 d龄SD大鼠，在无菌条件下开胸取心脏，立即置入4 DHanks液(NaCl 137、KCl 5.4、Na2HPO4 0.37、K2HPO4 0.44、NaHCO3 4.2 mmol/L)中截取心室肌，洗净残血，剪成约1 mm3大小的组织碎块。弃去DHanks液加入0.08% 胰蛋白酶液1015 mL，于37 磁力搅拌消化10 min，吸出上层悬液，并加入等量含血清培养基，经中止消化后离心(2 000 rpm/min，5 min)弃上清。再加入胰蛋白酶消化液消化10 min， 如此重复消化68次，分别收集各次细胞悬液，加入含血清的培养液，吹散沉淀细胞，同条

13、件下再次离心。 将各次离心沉淀后的细胞合并，用10% 血清培养液制成细胞悬液，置37 ，5%CO2培养箱内。根据心肌细胞与非心肌细胞贴壁时间的不同，采用2 h差速贴壁，分别获得心肌细胞和CFs。CFs培养至第6天传代，实验用第25代细胞。所有细胞均2 d换液1次。 1.3 心脏CFs羟脯氨酸含量测定差速贴壁法分离心脏CFs，传代培养，取培养25代细胞，0.125%胰酶消化细胞后，制成细胞悬液，等量(1 mL)接种于24孔板，常规培养72 h分别换入含Ang或所选各种干预因子的0.5%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48 h后，以Kivikikko法11测定CFs羟脯氨酸(hydroxypro

14、line)含量。每组测定6孔细胞，取其平均值。因可水解的羟脯氨酸为胶原特异性羟脯氨酸，其含量在胶原中基本恒定(约占13.6%)，故所测培养CFs胶原含量以羟脯氨酸含量×7.4表示，以此推算出培养心脏CFs胶原含量12。心脏CFs羟脯氨酸测定方法如下：以5%三氮乙酸(TAC)提取2次，提取液混合，加终浓度为5.7 N的盐酸，在具塞试管内放置110 烘箱水解24 h。取水解液加氧化剂(氯胺T溶液)，放置25 min，加Ehrich's试剂(1%对二甲氨基苯甲醛)，80 水溶液显色20 min，自来水冷却5 min，紫外分光光度计(CE2020型，英国)560 nm处测定样本OD值

15、。羟脯氨酸标准另配成标准液，分别为2.0，4.0，8.0，10.0 g/mL，蒸馏水为空白对照，做标准曲线。羟脯氨酸标准曲线回归方程为：Y=18.58D0.035，相关系数r=0.999 96(P<0.001)。通过标准曲线求出样本中羟脯氨酸含量，胶原含量以羟脯氨酸含量×7.4表示13。1.4 主要试剂与药品(1)DMEM培养基： BOEHRINGER MANNHEIM公司产品，由去离子双蒸水配制，正压过滤除菌，pH 7.2， 4 保存。(2)Hanks液组成(mmol/L):NaCl 137，KCl 5.4，MgSO4 0.81，Na2HPO4 0.37，K2HPO4 0.3

16、4，NaHCO3 4.2，Glucose 5.0，三蒸水配制，pH 7.2，高压蒸汽灭菌，4 保存。(3)DHanks酶消化液：胰蛋白酶(Difco进口分装，1250) 用无钙镁的Hanks液配制成0.08%液，pH 7.2，经0.22 m微孔滤膜除菌后，20 保存。(4)胎牛血清：中国医学科学院血液学研究所产品，20 保存。(5)含血清培养液： DMEM培养液临用前加入10%胎牛血清、青霉素100 U/mL，链霉素100 g/mL。(6)无血清培养液DMEM培养液：胰岛素10 g/mL，转铁蛋白 10 g /mL，VitC 100 mol/L，VitB12 1.5 mol/L，青霉素100

17、U/mL，链霉素100 g/ml。(7)血管紧张素II (Angiotensin II， AngII):Sigma公司产品，分子量为1 046.2，八肽(AspArgVolTyrLieHisProPhe )，无菌条件下配成10-4 mol/L溶液，20 保存。(8)Saralasin：血管紧张素II受体拮抗剂，Sigma公司产品，分子量为912.1。(9)百日咳毒素(pertussis toxin，PTX):Sigma公司产品。(10)L精氨酸：Sigma公司产品，分子量为174.20。(11)NG硝基左旋精氨酸甲酯(NGnitroLargingie methyl ester, LNAME):

18、 Sigma公司产品，分子量为269.7。1.5 统计学处理所有数据输入计算机，用SPSS 13.0 for Windows统计软件包进行t检验和单因素方差分析，数据以均数±标准差(±s)表示，以P<0.05作为差异有统计学意义。2 结果2.1 Ang对心脏成纤维细胞培养液胶原含量的影响在培养液中加入Ang 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105 mol/L，心脏成纤维细胞胶原含量分别为(68.3±8.4)、(86.2±10.5)、(101.1±13.6)、(119.9±14.3)和(123.3±14.2) g/(mg·pr)，5组Ang与对照组(59.6±7.8) g/mg·pr)相比，除1×109 mol/L组差异无统计学意义，其余各组均差异有统计学意义(P< 0.050.001)，并呈现明显的剂量依赖性，但1×106 mol/L组 与1×105 mol/L组相比差异无统计学意义(图1)。2.2 Ang受体拮抗剂Saralasin的作用单纯给予Ang受体拮抗剂Saralasin 1×107mol/L，CFs胶原含量