骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究

1、骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究         08-03-05 09:08:00     编辑：studa20                   作者：毛平曾进龙王彩霞杜庆华 【摘要】  为了探讨胚胎骨髓基质细胞（FBMSC）联合细胞因子对脐血单个核细

2、胞（MNC）中CD133+细胞的体外扩增作用，将新鲜脐血（CB）中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组：C组为空白对照组，不含基质细胞和细胞因子；S组为单用基质细胞组；F组为单用细胞因子组；SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组。在第0，6，10及14天检测有核细胞总数、CD133+细胞数及集落形成单位（CFU）数。结果表明：各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组；除了第14天外，SF组在第6、10天时CD133+细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组。结论： 胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用，基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞

3、及其中的CD133+细胞，这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法。 【关键词】  骨髓基质细胞； 造血干细胞； 细胞扩增； CD133+细胞； 脐血； 细胞因子In Vitro Expansion of Cord Blood CD133+ Cells Supported by Bone Marrow Stromal Cells and Cytokines       Abstract    The aim of this study was to investigate the e

4、ffects of human fetal bone marrow stromal cells (FBMSC) in combination with exogenous cytokines on supporting  in vitro expansion of CD133+cells in cord blood mononuclear cells (MNC). MNCs separated from cord blood (CB) were cultured for up to 14 days in a serumfree system with FBMSC or exogeno

5、us cytokines or both of them. On day 0,6,10 and 14, total nucleated cells (TNC) were counted；CD133+ cells were quantified  by FACS, and hematopoietic progenitor cells were assessed by semisolid culture assay. The results showed that the number of TNC was remarkably increased in FBMSC and cytoki

6、ne group, the expansion of CD133+ cells and  CFU were increased in FBMSC  and cytokine group except that on day 14. It is concluded that FBMSC play an important role in delaying the differentiation of hematopoietic cells. FBMSC in combination with exogenous cytokines can promote the effect

7、ive expansion of CB MNC and CD133+ cells, this expanding system may meet the needs for clinical application of expanded CD133+cells.    Key words    bone marrow stromal cell; hematopoietic stem cell; cell expansion; CD133+ cell; cord blood; cytokine    CD

8、34是目前造血干细胞（HSC）最常用的表面抗原标志。随着对HSC研究的深入，人们发现存在CD34抗原尚未表达的造血干细胞1，又发现部分AC133可能是比CD34更早表达的表面抗原2，3，在第七届人类白细胞分化抗原大会上AC133正式命名为CD133，CD133+细胞比CD34+细胞具有更高的增殖和自我更新能力4。我们利用本实验室已经建立的人胚胎骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系5，以脐血MNC为起始细胞，研究脐血CD133+细胞的体外扩增潜能。    材料和方法    主要试剂和仪器    羟

9、乙基淀粉液（HES）购自美国B.Braun公司。人淋巴细胞分离液（FicollHypaque，密度1.077）购自天津灏洋公司。25 ml一次性塑料培养瓶购自美国Becton Dickinson公司。DMEMLG培养液及胎牛血清（FBS）购自Gibco公司。青霉素和链霉素购自HyClone公司。无血清培养液使用Stem spanTM SFEM，造血祖细胞半固体培养基使用MethocultTMGF H4434，圴购自加拿大Stem Cell Technologies公司。干细胞因子（SCF）、酪氨酸激酶3类配基（FL）、血小板生成素（TPO）均购自英国PeproTech公司。CD133PE购自德

10、国Miltenyi Biotech公司。流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司FACS Vantage产品。    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(2)骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究胚胎骨髓基质细胞滋养层的建立    经家属知情同意后，取自然流产的胚胎（4-5月）3个。无菌条件下冲出骨髓液，经Ficoll离心后获得MNC，以1×106/cm2接种于5 ml的DMEMLG培养液中（含有20% FBS，  100 U/ml青霉

11、素，100  g/ml链霉素）。48小时后全量换液弃去悬浮细胞为原代细胞（F0），以后每隔5天进行半量换液。贴壁细胞融合达到80%时以0.05%胰酶消化传代后为F1，F3 至F5代的基质细胞,经15Gy 射线照射,用于共培养，使用之前用PBS洗涤3次。    脐血MNC的制备    足月妊娠的健康产妇脐血，经病人及家属知情同意后取自本院，共10份，ACDA抗凝。所采脐血在4小时内按41体积比与HES混匀之后静置30-45分钟沉淀红细胞，吸取上清经Ficoll密度梯度离心分离出单个核细胞（MNC），用PBS洗涤3次后备用。&#

12、160;   脐血MNC的液体培养体系及实验分组    采用Stem SpanTM无血清培养体系，SCF、FL、TPO的终浓度均为50 ng/ml。实验分为4组：C组：空白对照组，仅有培养基+MNC；S组：基质细胞+MNC；F组SCF+FL+TPO+MNC; SF组：基质细胞+SCF+FL+TPO+MNC。脐血MNC的接种密度为1×106/ml，置37、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。分别在第6、10、14天进行半量换液，检测细胞总数和CFU数，用流式细胞术检测CD133表达的情况。所得数值与第0天数值为1.00的相应数值作比较。

13、    造血祖细胞集落培养    将细胞按2×105/ml接种到24孔板MethocultTMGF H4434半固体培养液中，内含1%甲基纤维素、30% FBS、 1% BSA、 10-4mol/L 2ME、 50 ng/ml rhSCF、 50 ng/ml GMCSF、 10 ng/ml rhIL3、  3 U/ml rhEPO。造血祖细胞集落培养第14天时在倒置显微镜下计算CFU集落数。    细胞表面标志的流式细胞术检测    流式细胞试剂有CD13

14、3PE单克隆抗体.。流式细胞仪检测每个样品收1×104个细胞。使用CellQuest软件系统进行分析。    统计处理    用SPSS统计软件进行分析，结果以±SD表示，差异显著性采用方差分析。    结    果    胚胎骨髓基质细胞滋养层的建立    胚胎骨髓细胞经全量换液后，贴壁细胞经7-9天培养后即达到80%融合，主要为长梭形的成纤维细胞，原代细胞尚可见少量圆形贴壁细胞及黏附于贴壁细胞

15、表面的造血细胞。经2次传代以后成纤维细胞得以纯化，呈平行或旋涡状生长。经射线照射后，基质细胞能在Stem spanTM SFEM无血清培养液中继续培养18-20天而不发生脱落，台盼蓝染色显示活力>95%。    脐血、MNC、CD133+细胞数    所采集脐血的容量平均为65.7 ml (52-92 ml),收集的MNC数为（1.2±1.3）×108个，新鲜脐血MNC中CD133+细胞的所占比例为（0.92±0.31）%。    培养过程中有核细胞总数的变化 

16、;   C组、F组在培养过程中有核细胞总数一直呈下降趋势，尤其C组下降迅速，第6天的有核细胞总数为第0天的0.55±0.20，至第14天仅剩0.14±0.07。F组有核细胞数的下降速度较平缓，分别为0.92±0.30、0.88±0.29和0.66±0.36，但组内不同时间点比较均无差异（P>0.05）。S组在第6天有所下降，为第0天值的0.87±0.32，之后则一直增加，但增幅小，虽然第6天和第14天差异明显（P<0.01）,但在相邻时间点即第6天与第10天，第10天与第14天比较时均P>0.05

17、。SF组在第6天、第10天细胞总数明显扩增，第10天达到组内最高值，为第0天值的2.29±0.73，第14天略有下降，为第0天值的2.19±0.66，但跟第6天比较并不明显（P>0.05）。    在相同的时间点里，SF组有核细胞总数的扩增倍数均比其它组要高（P<0.05）（附表）。    CD133+细胞数变化    C组、F组CD133+细胞数虽然在第6天都有所增加，但之后即第10天和第14天均已低于初始水平，C组在第14天CD133+细胞基本已经消耗殆尽。S组和SF组在第6天，第10天都保持着增长的趋势，S组在第6天、第10天分别为第0天值的（4.06±1.44）倍和（4.51±1.8