第一章 1-4大肠杆菌感受态细胞的制备和转化_图文

1、1第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生51062l07个转化

2、菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。制备的感受态细胞可贮存于-70,数月至1年。但保存时间过长会使转化效率受到影响。新鲜细胞4 保存可用5天。用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。(具体操作及参数,参考仪器说明3下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的:转化缓冲液中试剂的纯度细胞的生长状态玻璃和塑料器皿的清洁度4例:Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:1从于37培养1620小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径23mm ,转到一个含有1

3、00ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。于37剧烈振摇培养约3小时。为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔2030分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0。3于4 ,离心10分钟,以回收细胞。4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。55以10ml 用冰预冷的0.1mol /L Cacl 2重悬每份沉淀,放置于冰浴上。6于4,离心10分钟.以回收细胞。7倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的这量培养液流尽。8每50ml 初始培养

4、物用2ml 用冰预冷的0.1mol /L CaCl 2重悬每份细胞沉淀。9分装成200ul ,贮存于-70、4 备用。转化6三、转化方法:电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。化学方法(热激法:使用化学试剂(如CaCl 2制备的感受态细胞,通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞。7电转化法:当大肠杆菌暴露在电场中时,细胞膜会不稳定而诱导形成暂时孔洞,于是DNA 分子进入细胞。电穿孔法最初用于将DNA 导入真核细胞,通过优化各个参数,每微克DNA 可以得到1091010转化体。影响参数:电场强度;电脉冲的长度;DNA 浓度;质粒的大

5、小。一般电转化的效率是用化学方法制备的感受态细胞的转化率的1020倍。而且,制备用于电穿孔的细胞要比制备感受态细胞更容易得多,低盐溶液或水洗,加10%的甘油,-70保存。8化学方法:1用贮存于-70、4 或新鲜的感受态细胞悬液中各取200ul 转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA (体积10ul ,DNA 50ng ,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30分钟。2将管放到预加温到42的循环水浴中,恰恰放置90秒,不要摇动试管。3快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却12分钟。4每管加800ul SOC 培养基。用水浴将培养基加温至37,然后将管转移到37摇床上,温育45分钟使细菌复苏,并且表达质粒编

6、码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率,在复苏期中,应温和地摇动细胞。95将适当体积(每个90mm 平板可达200ul 已转化的感受态细胞转移到含20mmol /L MgS04和相应抗生素的SOB 琼脂培养基上。用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。6将平板置于室温直至液体被吸收。7倒置平皿,于37培养,1216小时后可出现菌落。10第七节含重组质粒的细菌菌落的鉴定几种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落:1小规模提取质粒DNA 进行限制酶切分析;2互补;3插入失活;4杂交筛选5菌落PCR 。11一、小规模制备质粒DNA 进行限制酶切分析要挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养

7、,分离质粒DNA 后用限制酶进行消化,再通过凝胶电泳进行分析。该方案颇费气力,但这是首选的方法。在实际应用中,有可能在23小时内提取和分析36份小量制备的质粒DNA 。12二、互补许多载体都带有Lac Z 基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补(-互补。当这种载体转入可编码-半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-D 硫代半乳糖苷(IPTG 的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。实现-互补现象。由互补产生的-半乳糖苷酶(Lac Z 能够作用于生色底

8、物(X -gal 而产生蓝色的菌落,当在载体的该基因编码序列之间的多克隆位点,插入一个外源DNA 片段时,会造成Lac Z (基因的失活,破坏-互补作用,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。13-互补现象的检查:1在一事先制备好的含相应抗生素的LB 琼脂平板上加40ul X gal 贮存液(以20mg /ml 的浓度溶于二甲基甲酰胺中和4ul (IPTG 溶液(浓度为 200mg /ml 。溶液涂布在事先制备的琼脂平板表面。X -gal 贮存液的配法:将X -gal 溶于二甲基甲酰胺中,配成20mg /ml 浓度的溶液,装于玻璃或聚丙烯管中,装溶液的管应以锡铂包裹以防可见光使X

9、 -gal 受到破坏,应贮存于-20保存。该溶液不必过滤除菌。IPTG 溶液的配法:将2g IPTG 溶于8ml 水中,用水调节体积到10mL 。用0.22um 一次性滤器过滤除菌,分装成1ml 小份,贮存于-20142将待检细菌接种到平板上,用接菌环或牙签划线接种,也可将100ul 细菌悬液涂布在琼脂培养基表面。倒置平板于37培养1216小时。3于4将平板放置数小时,使蓝色充分显现。带有-半乳糖苷酶活性蛋白的菌落中间为谈蓝色,外周为深蓝色。白色菌落偶尔也在中央出现一个淡蓝色斑点,但其外周无色。互补蓝白斑选择15三、插入失活这种方法只能用于比较老的载体(如pBR322,这些载体带有两个或更多个

10、抗生素抗性基因和分布适宜的限制酶切位点。待插入的DNA 及已纯化的质粒DNA 都用限制酶消化,这些酶的识别位点只位于一个抗生素抗性基因区内。在适宜浓度下将两个DNA 连接后,用连接产物转化大肠杆菌,选择对第二种抗生素有抗性的转化体。1617在氨苄青霉素存在下生长的菌落,一些含有重组质粒,而另一些可能含有无外源DNA 而在连接过程中自身环化的质粒DNA 。为区别两种转化体,用两种分别含有氨苄青霉素和四环素的平板,在互相对应的位置上,各自接入同一菌落。在四环素平板中存活并生长的菌落没有外源DNA 插入。在四环素平皿中不生长而在氨苄青霉素平板中生长的菌落含有带失活的ter r 基因的质粒,这些质粒可

11、能带有外源DNA 序列。18通过灭活质粒所携带的抗生素抗性基因来筛选外源DNA 的插入19Figure 4.18. Recombinant selection withpBR322. See text for details. The inset shows how replica plating is performed.20四、杂交筛选一种在硝酸纤维素滤膜上原位裂解细菌菌落并使释放出的DNA 非共价结合于滤膜的方法,结合于滤膜上的DNA 可与相应的放射性标记核酸探针进行杂交。是鉴定含目的DNA 的重组质粒最常用的技术。很容易同时筛选数十万个细菌菌落,从中找出带有含靶序列的重组质粒的菌落,最

12、后,小量制备质粒DNA 进行限制酶切分析和Southern 杂交以证实这些质粒的结构。21固体支持体及其特点:1尼龙膜:最耐用,可以承受几轮杂交及高温洗膜操作,可用于不同的探针依次筛选的情况。2Whatman 541滤纸:有很高的湿强度,主要用于筛选一些基因文库。(保存在微量滴定板各个孔内的单菌落复印菌落转移到滤纸上。裂解、固定,用于杂交。3硝酸纤维素滤膜:与Whatman 541滤纸相比杂交信号较强,更适合常规的细菌筛选。22现有许多方法可用于放射性探针在溶液中与固定在滤膜上的核酸的杂交,这些方法在以下方面有所不同:1所用的溶剂和温度(如于68在水溶液中或于42在50%甲酰胺中。2溶剂的体积

13、和杂交的时间(体积大时可长达3天,或体积最小时,短至4小时。3振摇的程度和方法(持续摇动或固定。4阻断探针对固相基质表面的非特异性吸附的试剂,如Denhardt试剂或BLOTID 。5标记探针的浓度及其比活度。6可增进核酸重缔合率的化合物,如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇的使用情况。7杂交后洗膜的严格程度。23(一将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上适用于对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(100200进行筛选。将这些菌落归并到一个琼脂主平板,和第二个琼脂平板表面的一张滤膜上。培养一段时间后,对菌落进行原位裂解。主平板贮存于4 直至得到筛选结果。1在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张滤膜。2用无菌牙签将各

14、个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。按一定的格子进行划线接种(或打点,划出长23mm 的短线。每一菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒(如pBR322的菌落。(阴性对照以区分放射性标记探针与重组质粒的特异性退火和非特异性的杂交背景。243倒置平板,于37培养.直至划线的细菌生长达到0.51.0mm 的宽度。4用针头穿透滤膜直达其下的琼脂,在硝酸纤维素滤膜3个以上的不对称位置作标记。在主平板相同的位置上也作上标记。5用Parafilm 膜封好主平板,倒置贮放于4,直至获得杂交反应的结果。6裂解细菌,使DNA 结合于硝酸

15、纤维素滤膜。25(二将菌落影印在硝酸纤维素滤膜上方法一:适用于必须通过杂交来筛选大量菌落时,如用质粒载体构建的cDNA 文库转化细菌并铺平板。这时直接用转化混合物将细菌铺于一张无去污剂的硝酸纤维素滤膜上,然后通过滤膜与滤膜之间的接触制备影印滤膜。26方法二:适用于同时从琼脂平板表面把许多细菌菌落转到硝酸纤维滤素膜上。可用于任意大小的菌落,但小菌落(0.10.2mm 效果最佳,与较大的菌落相比,小菌落的杂交信息更清晰,而弥散程度更低。可用此技术在每张138mm 滤膜上筛选多达2l04个菌落或在每张82mm 滤膜土筛选104个菌落。27操作:1、方法11用一支软铅笔或圆珠笔给干的无去污剂的硝酸纤维

16、素滤膜编号,然后用水浸湿,将其夹在于的Whatman 3mm 滤纸中间,用锡箔包裹整叠夹好的滤膜,高压蒸气灭菌151bf /in2(1.034x105Pa。准备足够的滤膜以便用每个平板制备1张主滤膜和2张影印滤膜。2用无菌平头镊子把一张无菌滤膜放到前一天制备的含相应抗生素的LB(或SOB琼脂平板上,编号的一面朝下,当滤膜彻底湿润后,将滤膜从琼脂平板上剥离,编号的一面朝上放到琼脂表面上。283将悬于体积较小的液体中的细菌放到位于琼脂平板表面的滤膜中央。用一无菌的玻璃涂布器均匀地将菌液涂布在滤膜表面,滤膜的边缘留出23mm 宽的无菌边界。平板(不倒置半开盖几分钟使接种物蒸发,盖好,倒置平皿。于37

17、培养至小菌落(直径0.10.2mm 出现(约810小时。4将滤膜(菌落面朝上转到含相应抗生素和25%甘油的LB (或SOB 琼脂平板上,于37培养2小时。5用Parafilm 膜封好平板,倒置装在一密闭的塑料袋内,于-20贮存。于室温将主平板(仍倒置融化,即可制备影印滤膜。296按下述方法制各影印滤膜:a.事先准备一叠Whatman 3MM 滤纸(每张滤膜1张,略有富余,切成比滤膜稍大一些,高压下蒸气灭菌10分钟b .从贮存平板剥下主滤膜,菌露面朝上放在湿的无菌3mm 滤纸上。c .将一张湿的无菌硝酸纤维素滤膜编号,放在主滤膜上,注意防止两张滤膜间留有气泡。避免滤膜间相互发生移位。但使它们不致

18、恰好重叠,分离两张滤膜时会容易些。d.用丝绒影印铺板器或一个重玻璃平皿(在玻璃和滤膜之间有一张3mm 滤纸将两张滤膜紧紧地压在一起。30e. 针头在两张滤膜上制作一系列定位标记孔。f.分开两张滤膜,把影印滤膜放到一新鲜的含相应抗生素的LB (或SOB 琼脂平板上,于37培养至出现菌落(46小时。g.将主滤膜重新放回一新鲜的合相应抗生素和25%甘油的LB (或SOB 琼脂平板上。于37培养1小时,然后按步骤5进行冻存处理。7裂解细菌,释放的DNA 结合到影印滤膜上。维 素 滤 膜 上 的 细 菌 菌 落 用 影 印 铺 板 器 复 印 生 长 在 硝 酸 纤 2方法2 方法2 1）直接将细菌悬液

19、铺于含相应抗生素的LB（或SOB）琼 ）直接将细菌悬液铺于含相应抗生素的LB（ SOB） 脂平板培养表面。将平板半开盖放在层流式通风橱到琼 脂表面完全干燥，盖好平皿倒置放于37培养1214小 脂表面完全干燥，盖好平皿倒置放于37培养1214小 时。于4放置3060分钟。 时。于4 放置3060分钟。 2）用铅笔或圆珠笔将硝酸纤维滤膜编号。编号的一面超 下，将滤膜放到LB（或SOB）琼脂培养基表面，与菌落 下，将滤膜放到LB（ SOB） 接触直到膜完全湿润。用针头穿透滤膜和下面的琼脂作 3个或3个以上的不对称标记。 个或3 3）用平头镊子剥离滤膜。 31 32 4）有几种方法选择： a.使粘在滤

20、膜上的细菌立即裂解，释放的DNA结合于滤膜上。 a.使粘在滤膜上的细菌立即裂解，释放的DNA结合于滤膜上。 b.菌落向上使膜放在新配制的含相应抗生素的LB（或SOB）琼脂平 b.菌落向上使膜放在新配制的含相应抗生素的LB（ SOB） 板的表面。培养几小时后细菌长到23mm时可裂解菌落。 板的表面。培养几小时后细菌长到2 mm时可裂解菌落。 c.可将滤膜转移至含氯霉素（170200ugml）的琼脂平板上，于 c.可将滤膜转移至含氯霉素（170 200ugml） 37培养12小时（扩增）。在正常情况下，不用扩增，就可以杂 37培养12小时（扩增）。在正常情况下，不用扩增，就可以杂 交检出克隆化的D

21、NA序列。只有当载体可进行松弛型复制时，才 交检出克隆化的DNA序列。只有当载体可进行松弛型复制时，才 能进行扩增。 d可用滤膜来制备第二张影印滤膜，使带菌落的面朝上，将滤膜 放在新鲜的含相应抗生素的LB（或SOB）琼脂平板表面，然后小 放在新鲜的含相应抗生素的LB（ SOB） 心地将第2张干的硝酸纤维素滤膜放到第1张滤膜上，并与之对准。 心地将第2 张干的硝酸纤维素滤膜放到第1 将滤膜夹层一起放于37培养数小时。 将滤膜夹层一起放于37培养数小时。 （三）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜 （三）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜 介绍两种方法，都应尽力避免将任何溶液留在滤膜 的上表

22、面，尽力避免在滤膜下面留有气泡。 1.方法1： 1.方法1 1）切4张大小及形状适宜的Whatman 3mm滤纸，端正地放 ）切4 张大小及形状适宜的Whatman 3mm滤纸，端正地放 于4个玻璃盘或塑料盘的底部，每张3mm滤纸用下面溶液 个玻璃盘或塑料盘的底部，每张3 mm滤纸用下面溶液 中的一种饱和： a.10SDS（可用可不用）。 a.10 SDS（ b.变性液（0.5molL Na0H、1.5molL NaCl）。 b.变性液（0.5mol Na0H、 1.5mol NaCl）。 c.中和液1.5molL Nacl 0.5molL TrisCl c.中和液1.5mol 0.5mol

23、Tris （pH7.4） pH7.4） d2SSC。 SSC。 倒掉任何多余的液体 34 5）于37培养主平板57小时直到菌落再生，用 ）于37培养主平板5 Parafilm膜封好，倒置贮放于4。 Parafilm膜封好，倒置贮放于4 33 2）用平头镊子把硝酸纤维素滤膜从平板上剥离下来，菌 落面朝上放于浸过SDS的滤纸上，可以限制质粒DNA在变 落面朝上放于浸过SDS的滤纸上，可以限制质粒DNA在变 性和中和期间发生扩散。 3）第1张滤膜在SDS溶液中暴露3分钟后将其转到第2张用 ）第1 张滤膜在SDS溶液中暴露3 分钟后将其转到第2 变性液饱和的滤纸上。按顺序进行转膜，使之暴露于变 性液5

24、分钟。 性液5 4）将滤膜转到第3张用中和液饱和的滤纸上，放置5分钟。 ）将滤膜转到第3 张用中和液饱和的滤纸上，放置5 5）将滤膜转到一张用2SSC饱和的滤纸上，作用5分钟。 ）将滤膜转到一张用2 SSC饱和的滤纸上，作用5 6）使菌落面朝上，将滤膜放到一张干的滤纸上，于室温 干燥至少30分钟。 干燥至少30分钟。 7）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80干烤12小时， ）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80干烤1 以固定DNA 。 以固定DNA 8）将固定好的膜与32P标记的探针杂交 35 2方法2： 方法2 1）每一张滤膜，在一包装膜上制作一个装有0.5molL ）每一张滤膜，在一包装膜上制

25、作一个装有0.5mol NaOH的小 洼（0.75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到 NaOH的小 洼（0.75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到 小洼上，展平Saran包装膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜 小洼上，展平Saran包装膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜 留于原处23分钟。 留于原处2 2）用干的纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的Saran ）用干的纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的Saran 包装和新配制的0.5molL NaOH重复步骤1）。 包装和新配制的0.5mol NaOH重复步骤1 3）再次吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1molL ）再次吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1 mol T

26、risCl （pH7.4）的Saran包装膜小洼上。5分钟后， Tris pH7.4） Saran包装膜小洼上。5 吸干滤膜，用一张新的Saran包装膜和新的1molL 吸干滤膜，用一张新的Saran包装膜和新的1 mol TrisCl （pH7.4）重复该步骤。 Tris pH7.4） 36 6 （四）杂交 4）吸干滤膜，把它转到新的带有1.5molL NaCL 0.5mol ）吸干滤膜，把它转到新的带有1.5mol L TrisC1（pH7.4）的包装膜小洼上，5分钟后，吸 Tris C1（ pH7.4） 的包装膜小洼上，5 干滤膜，把它转移到一张干的滤纸上，于室温晾至少20 干滤膜，把它

27、转移到一张干的滤纸上，于室温晾至少20 30分钟，使滤膜干燥。 30分钟，使滤膜干燥。 5）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80干烤2小时，以固 ）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80干烤2 定DNA。 DNA。 6）将固定在膜上的DNA与32P标记的探针杂交。 将固定在膜上的DNA与 该方案可用于30张直径为82mm的圆形硝酸纤维素滤膜。可 该方案可用于30张直径为82mm的圆形硝酸纤维素滤膜。可 根据杂交反应中所用滤膜的数量和大小适当调整体积。 37 1）盘内盛有2SSC，将烤干的滤膜飘浮在液面上，直到 ）盘内盛有2 SSC， 滤膜从下到上彻底浸湿。浸泡5分钟。 滤膜从下到上彻底浸湿。浸泡5

28、2）将滤膜转到一个盛有200ml预洗液的玻璃皿中，将滤膜 ）将滤膜转到一个盛有200ml预洗液的玻璃皿中，将滤膜 一张张叠在一起，放于溶液中。用Saran包装膜盖住结 一张张叠在一起，放于溶液中。用Saran包装膜盖住结 晶皿，放到位于培养箱内的旋转平台上。在这一步及以 后的所有步骤中，应缓缓摇动滤膜，防止它们粘在一起， 于50温育30分钟。 50温育30分钟。 预洗液： 5SSC 0.5SDS 0.5 38 1mmolL EDTA（pH8.0） 1mmol EDTA（ pH8.0） 3）用泡过预洗液的纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片，这 样可以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度或清 晰度。

29、4）将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃皿中，在适宜温 ）将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃皿中，在适宜温 度（即在水溶液中杂交时用68而在50甲酰胺中杂交 度（即在水溶液中杂交时用68而在50甲酰胺中杂交 时用42）下，温育12小时。 时用42）下，温育1 5）将32P标记的双链DNA探针于100加热5分钟，使其变 标记的双链DNA探针于100加热5 性。迅速将探针放冰浴中冷却。单链探针不必变性。 将探针加入覆盖滤膜的预杂交液中，在适当温度下， 温育直至达到13Cot1/2 杂交期间,盛滤膜的容器应 温育直至达到1 杂交期间, 盖严以防液体蒸发。 6）杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大 体积（300500ml）的2SSC和0.1SDS溶液中，轻 体积（300500ml） SSC和 0.1 SDS溶液中，轻 轻振摇。在洗膜过程中，至少将滤膜翻转1次。5分钟 轻振摇