西罗莫司高产突变株FC904-33

1、西罗莫司高产突变株FC904-33                    作者：黄捷 金东伟 余辉 程元荣【摘要】  西罗莫司是吸水链霉菌FC904产生的新型强效免疫抑制剂。为了获得高产西罗莫司突变株，采用UV、硝苯胍和甲基磺酸乙酯诱变剂诱变处理吸水链霉菌FC904的孢子悬液和发芽孢子，随后用西罗莫司对存活菌株进行自身代谢产物的耐受性试验，获得西罗莫司高产突变株FC904-33，其生物合成能力是原

2、出发菌株的4.6倍。本文报道该突变株的培养特征、对抗生素的敏感性、西罗莫司生产能力和副产物等。 【关键词】  西罗莫司； 诱变育种； 生物合成   ABSTRACT  Sirolimus, a powerful immunosuppressant, is produced by Streptomyces hygroscopicus FC904. In an attempt to improve its production, mutation and screening were carried out. Spore suspensions and th

3、e forming buds were treated with UV, nitrosoguanidine (NTG) and ethylmethane sulfonate (EMS), some of survivors were selected and detected their resistance to sirolimus. A mutant FC904-33 with higher productivity of sirolimus was obtained and the features of the mutant such as fewer by-products and

4、the susceptibilities to antibiotics as well as its cultural characteristics were presented.   KEY WORDS  Siroliums;  Mutagenesis;  Biosynthesis   西罗莫司(sirolimus)原名雷帕霉素(rapamycin)，是吸水链霉菌产生的具独特作用机制的含氮三烯大环内酯化合物，具有抗真菌、抗增殖和抗肿瘤活性的新型强效免疫抑制剂。由于其特异地结合并抑制哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(manmali

5、an target of rapamycin，mTOR)的作用，已被用作器官移植抗排斥药物、自身免疫性疾病治疗药1，临床心血管支架涂料；西罗莫司及其的衍生物CCI-779、AP23573和RAD001正开发为靶向、低毒的抗肿瘤药物2。在生产过程中，西罗莫司菌种的生产能力是关键。本文报道应用物理、化学诱变因子联合诱变西罗莫司产生菌吸水链霉菌FC9043孢子悬液和发芽孢子，存活株再行对其自身代谢产物西罗莫司耐药性选择和营养代谢研究，获得突变株33#以及突变株33#的培养特征、抗生素敏感性及发酵调控。1  材料与方法   1.1  菌种  

6、 西罗莫司产生菌吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopcus)FC904，福建省微生物研究所保存，作为诱变育种的出发菌株。   1.2  培养基及培养条件   (1)琼脂斜面培养物  琼脂斜面培养基为燕麦片琼脂(ISP3)；自吸水链霉菌FC904沙土保存管中取出少许保存物或自生长好的琼脂斜面取出一环培养物接种于ISP3琼脂斜面上，28培养1520d，斜面表面培养物出现吸水黑斑，4保藏备用。   (2)种子培养  吸水链霉菌FC904孢子接种于种子培养基(主要成分有葡萄糖，酵母浸膏、蛋白胨

7、等，pH7.0，500ml三角瓶装80ml培养基)，28、220r/min振荡培养3648h。种子瓶外观浓稠， 显微镜观察菌丝呈网状，可作为移种的种子。   (3)发酵  36ml的种子培养物移入60ml发酵培养基中(主成分为：葡萄糖、淀粉、黄豆饼粉、蛋白胨等，pH6.0，三角瓶500ml)，28、220r/min振荡培养8496h，进行效价测定。   1.3  西罗莫司的检测   (1)标准品  西罗莫司标准品由福建省微生物研究所制备，经中国药品生物制品检定所标定，纯度99.8%。  

8、; (2)发酵液提取  发酵液经甲醇提取后2进行生物效价测定和/或HPLC检测。   (3)生物效价检测  生物效价检测采用纸片半固体琼脂扩散法3。   (4)HPLC检测  HPLC检测采用外标法。HPLC检测仪：Beckman System Gold，色谱柱：ODS C18，流动相：甲醇水(7525)，检测波长277nm，柱温40。   西罗莫司效价=标准品浓度×样品积分面积(tran+cis)×进样体积/标准品积分面积(tran+cis)×进样体积  

9、; 1.4  物理、化学诱变因子联合处理吸水链霉菌FC904   (1)UV和NTG联合处理吸水链霉菌FC904孢子  10ml孢子悬液置于9cm直径的培养皿中，在暗环境下经30W(2537)紫外灯、20cm距离照射10s后，再用NTG 3mg/ml(0.1mol/L Tris·Cl pH8.0缓冲液配制)28避光处理23h。终止反应后，孢子悬液重新悬浮于生理盐水中，稀释并涂布在ISP3琼脂平板上，28培养1015d。            (2

10、)EMS处理突变株27#发芽孢子和西罗莫司抗性菌株的筛选  将处理获得的突变株27#孢子接种于发芽培养基(葡萄糖1%，酵母浸膏0.6%，蛋白胨0.6%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH7.0，250ml三角瓶装30ml培养基)，28，220r/min振荡培养1820h，显微镜观察有逗号状芽头，10000r/min离心10min，弃上清液，收集发芽孢子，用0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液洗涤，最后悬浮在含EMS 0.5mol/L的0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液中，28作用4h。5000r/min离心5min，

11、去除含EMS的清液。采用稀释法终止反应后，发芽孢子移入与收集发芽孢子时等体积的上述发芽培养基中，继续在28振荡培养24h。离心收集菌丝体，悬浮于生理盐水中。超声波(型号：Siniprep150)破碎(置冰中，每次1min，间隔30s，共15min)至菌丝出现较均匀断枝，不同稀释度的这样处理液分别涂布于ISP3琼脂平板和含西罗莫司350450g/ml的ISP3琼脂平板上，28培养1015d。   1.5  抗生素的敏感性   采用固体琼脂二倍稀释法，培养基为ISP3琼脂，28培养10d观察结果。   1.6  3L自

12、动发酵罐发酵验证   采用美国NBS BIOFLU3000发酵罐进行。斜面孢子接入种子培养基，于28、220r/min振荡培养3648h后以10%接种量接入发酵培养基，28、11的通气量发酵8496h进行西罗莫司效价检测(HPLC)。发酵过程溶氧设置在40%，以搅拌转速来维持设定的溶氧值，搅拌转速控制在100400r/min之间。   2  结果   2.1  诱变处理   (1)UV和NTG对吸水链霉菌FC904的诱变处理  UV照射10s后用3mg/mlNTG处理吸水链霉菌FC90

13、4孢子悬液3h，致死率达99.2%。在挑取的2050株存活株中获得70株发酵水平较出发菌株提高20%以上的菌株(生物检定)，经过进一步筛选，获得5株发酵水平较出发株高50%以上的菌株(HPLC检测)，其中突变株27#的发酵水平约是出发菌株的2倍。   (2)EMS对突变株27#的诱变处理  0.5mol/L EMS处理突变株27#的发芽孢子，在ISP3琼脂分离平板和含西罗莫司ISP3的琼脂平板上分别挑取528株和242株存活株进行筛选，结果显示比出发菌株效价高20%以上(生物检测)的菌株分别有21株和23株；经过进一步的筛选并采用HPLC进行检测，在ISP3琼脂平

14、板上挑取的菌株发酵效价均不高于出发株，而在含西罗莫司的ISP3琼脂平板上挑取的菌株中有4株的效价较出发菌株提高50%。经传代培养，发现突变株33#发酵效价高(HPLC检测，表1)，组分较单一，性状稳定，生长快，孢子丰满。   2.2  高产突变株33#的性状研究   (1)菌落形态  在ISP3琼脂平板上，与出发菌株相比，突变株的菌落形态发生明显的变化。原出发菌株吸水链霉菌FC904菌落平坦，粉白色，平均直径56mm，背面无色素；突变株27#菌落高起，呈圆形多皱褶， 平均直径34mm， 背面无色素， 表面常出现白色表1 &#

15、160; 突变株与出发株的发酵水平比较的气生菌丝蒙面； 突变株33#菌落平坦，平均直径56mm，同心圆形，背面可见浅粉红色色素。   (2)出发菌株吸水链霉菌FC904与突变株的发酵产物和生产能力比较  吸水链霉菌FC904在沉没培养中，西罗莫司发酵效价低，还产生西罗莫司发酵过程常见的副产物洋橄榄素5。HPLC检测表明，突变株33#不但西罗莫司合成能力明显提高分别是突变株27#的2.4倍和出发菌株吸水链霉菌FC904的4.6倍(表1)，而且发酵液中洋橄榄素含量极微，组分比较单一(图1)。   (3)突变株33#的稳定性考察  表2结果

16、显示，菌株孢子琼脂斜面保存3个月，发酵效价无明显变化。   (4)抗生素敏感性试验  将链霉素、庆大霉素等抗生素应用于大环内酯化合物产生菌(特别是西罗莫司产生菌吸水链霉菌FC904)的选育已得到肯定的结果6，7。我们考察了突变株27#和33#对不同化学类群的五种抗生素的敏感性，结果表明，效价高、副产物少的突变株33#对两种氨糖抗生素的敏感度高于出发菌株吸水链霉菌FC904和突变株27#；对西罗莫司耐受性，突变株33#高于其他两个出发菌株；对丝裂霉素和利福平，与吸水链霉菌FC904和突变株27#有近似的结果(表3)。   2.3  3L

17、自动发酵罐的发酵   图2显示突变株33#在3L自动发酵罐的发酵参数。突变株33#糖、氮代谢正常； 西罗莫司合成始于40h，发酵至88h西罗莫司合成达到最高值。在发酵过   A：吸水链霉菌FC904；  B：突变株27#；  C：突变株33#。   SRL：西罗莫司；  cis：顺式异构体；  trans：反式异构体表2   突变株33#斜面保存时间的稳定性考察表3   西罗莫司出发菌株和突变株对抗生素的敏感度程中，随菌丝生长，pH大幅度下降，在西罗莫司合

18、成期维持在一个较低值，发酵后期略有回升；菌丝生长期对氧的需求较高，搅拌转速维持在最高设定值的400r/min，而西罗莫司合成期对氧的需求相对较低，到后期维持在较低水平(200r/min左右)。   3  讨论   关于西罗莫司菌种的选育，我们曾报道氨基糖苷类抗生素用于西罗莫司菌种选育中取得的结果，应用NTG处理吸水链霉菌FC904原生质体后在含庆大霉素1g/ml的溶液中再处理得到西罗莫司合成能力比吸水链霉菌FC904高129%的突变株C14-26。 本文采用物理和化学诱变剂联合处理吸水链霉菌FC904孢子和发芽孢子，再通过耐自身代谢产物西罗莫司

19、进行筛选获得一株较为优良的突变株33#；该菌株生物合成西罗莫司的能力是原始出发菌株吸水链霉菌FC904的4.6倍，突变株27#的2.4倍。该菌株在菌落形态等方面的性状与前两代菌株不同；在发酵代谢产物上，新菌株极少合成西罗莫司发酵时常见的副产物洋橄榄素，使下游的提取、纯化步骤更快捷、方便；此外，新菌株的斜面孢子稳定性好，F1代斜面在4保存3个月效价基本稳定，适合工业化生产的需要。以上结果在3L自动发酵罐上得到了验证。产生菌的选育是繁重而细心的劳动，选择理性和有效的育种手段需要进行反复的试验。本报道尤其是西罗莫司产生菌对某些抗生素的敏感性、对自身代谢产物的耐受性与西罗莫司合成能力的关系值得进一步探讨。【参考文献】