肝癌患者转化生长因子-β1及其受体的表达和意义

1、    肝癌患者转化生长因子-1及其受体的表达和意义        【摘要】目的探讨肝癌患者转化生长因子-1(TGF-1)及其受体的表达情况和意义。方法酶联免疫吸附法检测27例行胆囊切除术者(对照组)和36例肝癌患者(肝切除组)肝切除手术前后血清TGF-1浓度；免疫组织化学法检测36例肝癌和癌周组织标本中相关受体的表达情况。结果肝癌患者血清TGF-1浓度较对照组显著升高(P0.05)；患者肝切除术后血清TGF-1浓度较术前有显著升高(P0.01)，而胆囊切除患者则无明显变化。

2、癌组织与癌周组织受体表达的强度近似，但是部位有显著不同，36例癌周组织无论是否有肝硬化，受体 染色均为阳性，以在细胞膜表面线形浓聚为特点，36例癌组织中仅11例阳性，而且受体染色在细胞核周的胞浆中呈颗粒状浓聚，细胞膜表面则未发现受体染色。两者受体的染色阳性率差异有非常显著性(P0.01)。结论血清TGF-1水平可能是肝癌重要的血清标记物之一。肝叶切除能引起血清TGF-1水平的升高，但该因子受体只表达于癌细胞核周围的胞浆中，而在癌周组织中，则表达于细胞膜表面，提示癌细胞受TGF-1影响较小，故肝癌细胞的分裂增殖失控与TGF-1的抑制作用降低有关。【关键词】癌，肝细胞；肝切除；转化生长因子-1；受

3、体 Study of the expression of transforming growth factor-1 and its cell membrane receptors in patients with hepatocellular carcinomaQIAN Jianmin, WANG Xuehao, LI Guoqiang, et al.(Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)【A

4、bstract】 Objective To research the expression of TGF-1 and its cell membrane receptors in patients with hepatocellular carcinoma. Methods ELISA was employed to determine the concentration of TGF-1 in serum pre- and post cholecystectomy of 27 patients (C group). The concentration of TGF-1 in serum pr

5、e- and post hepatectomy and the TGF-1 receptors in liver tissue were determined in 36 patients with hepatocellular carcinoma (T group), respectively. Results The concentration of serum TGF-1 in T group were higher than that in C group (P0.05). The post-hepatectomy concentration of serum TGF-1 in all

6、 patients were greatly higher than that of pre-hepatectomy (P0.01), and the TGF-1 receptor complex of normal liver tissue expressed on the cell membrane, but in tumoral tissue it was perinuclear accumulation rather than displayed membrane labeling. Conclusion TGF-1 might be an important serum marker

7、 in patients with hepatoma. Hepatectomy can induce the enhancement of TGF-1 in serum. It was presumed that the escape of tumoral hepatocytes from the control of TGF-1 might be closely related to TGF-1 receptors expressed in the cytoplasm perinuclear rather than on the cell membrane.【Key words】 Hepat

8、ocellular, carcinoma; Hepatectomy; Transforming growth factor-1; Receptors     转化生长因子-1(TGF-1)是一种通过二硫键相连的同源性二聚体多肽。我们根据对肝癌患者血清TGF-1浓度及癌组织、癌周组织标本TGF-1受体的研究结果，分析TGF-1对肝癌发生、发展的影响及机制，初步探讨其在肝癌转移复发中的意义。 材料与方法1.试剂及辅助设备：TGF-1酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒由英国Genzyme公司生产，TGF-1受体系统免疫组织化学单克隆一抗(CD105)由美国Ph

9、armingen公司提供，ABC染色试剂盒购自美国Lab vision公司，其余试剂由南京医科大学第一附属医院肝癌研究室提供。TGF-1 ELISA检测辅助设备由南京医科大学第一附属医院临床中心实验室提供，TGF-1受体系统免疫组织化学染色辅助设备由南京医科大学第一附属医院病理科提供，免疫组织化学切片显微摄影设备由南京医科大学病理教研室提供。2.肝癌患者血清标本和肝组织标本的采取：27例胆囊切除患者及36例肝癌患者血清标本及肿瘤、癌周组织标本，全部来自于南京医科大学第一附属医院肝胆外科手术病例。患者手术前后4d各采血2ml。所得血液样本均在室温(1624)下静置8h，4冷藏8h后离心(2000

10、r/min)20min提取血清。所得血清标本均立即放置于-72冰箱保存备用。取得的所有肝脏组织标本均一式两份，1份立即送本院病理科做成石蜡包埋组织块保存备用；另1份常规固定送病理检查。肿瘤组织标本均经病理诊断证实为肝细胞癌。3.血清标本TGF-1浓度的检测：严格按照试剂盒说明操作，采用ELISA法1。4.肝癌、癌周组织标本中TGF-1受体表达水平的检测：严格按照试剂盒说明操作。采用免疫组织化学法2。主要步骤包括：(1)标本去石蜡化并且重新水化组织切片。(2)为了减少内源性过氧化物酶产生的非特征性的背景染色，用过氧化氢阻断剂将切片孵育1015min。(3)使用阻断剂处理切片并且在室温下反应5mi

11、n，以阻断非特征性的背景染色反应。(4)一级抗体按120稀释；加入一级抗体后，37温箱孵育(60±2)min。(5)加入生物素二抗并且在室温下静置充分反应10min。(6)加入耦合HRP的抗生物素蛋白，并且在室温下静置充分反应10min。(7)在1ml色原体底物中加入12滴(40100l)色原体，振荡混匀，加入组织中。37温箱孵育1015min。(8)复染并且永久性的封藏材料覆盖切片。镜下仔细观察、对比，统计染色阳性例数，显微摄影。5.统计学方法：t检验。结果1.肝切除组和对照组血清TGF-1浓度的比较：肝癌患者血清TGF-1浓度(46.58±13.51)g/L较对照组(1

12、6.12±7.82)g/L显著升高(P0.01)；对照组手术后TGF-1浓度(16.12±7.82)g/L较术前(14.58±7.51)g/L无明显变化(P0.05)，而肝癌患者肝切除术后血清TGF-1浓度(75.00±27.82)g/L较术前(46.58±13.51)g/L显著升高(P0.01)。2.肝组织中TGF-1受体表达情况(棕色为受体染色阳性)：人肝癌组织与癌周组织受体表达的强度近似，但是部位显著不同；36例患者癌周组织无论是否有肝硬化，受体染色均为阳性，以在细胞膜表面线形浓聚为特点；36例患者癌组织中仅12例阳性，而且受体染色在细胞

13、核周的胞浆中呈颗粒状浓聚，细胞膜表面则受体缺如。两者受体的染色阳性率差异有非常显著性(P0.01)。讨论本研究结果显示，肿瘤细胞和癌周细胞TGF-1受体表达的强度相似，而染色阳性率差异有非常显著性(P0.01)，受体表达部位也完全不同。TGF-1受体在癌周正常或肝硬化细胞膜表面呈线性浓聚，而在肿瘤细胞则表达缺如，或仅在细胞核周发现TGF-1受体颗粒状密集表达。由于肿瘤细胞和正常肝细胞膜表面TGF-1受体表达位置上的显著差异，使术后高强度表达的TGF-1能够有效抑制正常肝细胞的增殖；对肿瘤细胞而言，生长抑制信号转导因相关受体缺如和/或受体表达位置异常而最终无法完成。因此，我们认为肿瘤细胞对TGF

14、-1受体的这一特征性表达可能是肝癌细胞逃逸机体生长调控的重要机制之一。另外，由于TGF-1受体在肿瘤细胞核周有明显表达而在细胞表面则缺如，我们推测肝癌细胞表面TGF-1受体蛋白缺如的原因可能是肝癌细胞逃逸机体生长调控的重要机制之一。另外，由于TGF-1受体在肿瘤细胞核周有明显表达而在细胞表面则缺如，我们推测肝癌细胞表面TGF-1受体蛋白缺如的原因可能是蛋白合成后修饰和/或修饰后蛋白移位至细胞膜表面的过程发生障碍。根据本院研究的肝癌、癌周及正常肝细胞TGF-1受体的分布特点，可以推测肝切除由于引起TGF-1水平的增高，加之受体表达异常及机体免疫状态的变化，很可能是已有肝内微小转移灶的肝癌切除后复发的间接机制之一。作者单位：钱建民(南京医科大学第一附属医院肝胆外科 210029)王学浩(南京医科大学第一附属医院肝胆外科 210029)李国强(南京医科大学第一附属医院肝胆外科 210029)孙跃明(南京医科大学第一附属医院肝胆外科 210029)张浩(南京医科大学第一附属医院肝胆外科 210029)参考文献1，Ikubo A, Morisaki T, Katano M, et al. A possible role of TGF-1 in the