自稳定反义IGF1R基因片段对膀胱癌细胞的影响

1、    自稳定反义IGF1R基因片段 对膀胱癌细胞的影响         【摘要】目的探讨针对胰岛素样生长因子1受体（IGF1 R ）基因的自稳定反义脱氧寡核苷酸（ODN）对膀胱癌细胞的影响。方法采用RTPCR、Western blot、MTT试验、流式细胞仪对经反义ODN作用后的T24膀 胱癌细胞进行动态分析。结果自稳定反义ODN在血 清培养基中24h内均保持稳定状态，而硫代反义ODN 4h后基本降解。自稳定反义ODN可有效降 低T24膀胱癌细胞IGF1R基因及蛋

2、白表达，增强膀胱癌细胞对丝裂霉素的敏感性及凋亡易感性 。结论IGF1R基因的自稳定反义ODN可能是一种治疗膀胱肿瘤的 新途径。【关键词】基因膀胱肿瘤癌Effects of self-stablized antisense oligodeoxynucleotide targete d against IGF1R gene on T24 bladder cancer cellsSUN Hongzhi, FAN Jie, TANG Xiaoda.Department of Urology, Shanghai First People s Hospital Shanghai,200080,China【

3、Abstract】ObjectiveTo evaluate the effects of self- stablized antisense oligodeoxynucleotide （ODN） targeted against insulin-like growth factor 1 receptor(IGF1R) gene on T24 bladder cancer cells.MethodsSemiquantitative RT-PCR, Western blot , MTT determ ination, flow cytometry were used to study the ef

4、fects of self-stablized antisense ODN on IGF1R gene expression, protein synthesis, drug sensitivity and apoptosis of T24 cells.ResultsTh e self-stablized antisense ODN was stable in culture medium for 24 hours, where as phosphorothiate ODN were almost degradated after 4 hours in the same condition.

5、After treate d with self-stablized antisense ODN specific for IGF1R gene, the intrinsic mRNA expression of IGF1R gene were reduced approximately by 84.3%（phosphoroth iate ODN: 74.0%）, the protein synthesis of IGF1R were downregulated by 77.0% （phosphorothiate ODN: 61.3%）, which caused targeted cells

6、 to be m ore sensitive to mitomycin induced apoptosis （P<0.05）.Conclus ionsThese data showed antisense ODN with ability of anti-degradati on could effectively reduce IGF1R gene expressions and protein synthesis of T24 cells and could significantly enhance apoptotic sensitivity of T24 cells to bla

7、d der instilation drug-mitomycin.These suggested that IGF1R antisense ODN may serve as a potential therapeutic approach to bladder cancer.【Key words】GenesBladder neoplasmsCarcinoma胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)信号传递通路在肿瘤增殖、侵袭转移、凋亡调控等方面 具有重要作用1。我们采用自稳定反义脱氧寡核苷酸(ODN)阻断IGF1R基因表达， 以探讨阻断自分泌对膀胱癌细胞的影响，为探索膀胱肿瘤治疗新途径提供可行性依

8、据。材料与方法一、细胞培养T24膀胱癌细胞株由中国科学院上海细胞所提供，常规培养于含有10小牛血清的RPMI 16 40（GIBCO公司产品）中，实验所用细胞均处于对数生长期。二、反义ODN的设计合成IGF1R硫代反义ODN设计参阅文献2，其序列为：5'TCCTCCGGAGCCAGA*C*T*T*3' （*表示硫代修饰部位）;正义序列为5'AAGTCTGGCTCCGGA*G*G*A*3'。自稳定反义OD N序列由中国科学院细胞学研究所用oligo 5.0 软件设计，序列如下：<"01 (1067 bytes)" src="/m

9、ed/cano/201003/20100312173419195" 238 97>     以上序列由美国Cybersyn公司合成。ODN转染T24膀胱癌细胞采用非脂质体配方的F uGENETM6转染试剂（德国Roche公司产品），转染方法按说明书进行。三、反义ODN在血清培养液中稳定性的测定分别将IGF1R硫代反义ODN及自稳定反义ODN 5'端脱磷，-32P-dATP标记后加 入含有20小牛血清的RPMI 1640中，终浓度为10mol/L，于0、1、2、4、6、12、24 h取样进行变性PAGE凝胶电泳，-20自显影48h。

10、以上实验重复3次。四、反义ODN对膀胱癌细胞的影响1.自稳定反义ODN对 T24膀胱癌细胞IGF1R基因表达的影响：T24细胞按5×106/瓶接种于3 cm×5cm培养瓶中，分为 T24对照组、正义ODN组（10mol/L）、硫代反义ODN组（10 mol/L），自稳定反义ODN组（10mol/L），以高度表达IGF1R的K562白血病细胞为阳性对 照组，培养48h后抽取RNA（Triral试剂，GIBCO公司）。IGF1R、-actin基因引物设计参照文献3进行。实验重复3次。PCR产物经SynGene（美国）凝胶成像系统进行条带分析。所 检测指标的mRNA表达量用相对表

11、达量， 即检测指标/-actin，数据采用SPSS统计软件进 行配对t检验。2.自稳定反义ODN对 T24膀胱癌细胞IGF1R蛋白表达的影响：T24细胞按1×107/瓶接种于5 cm×8cm培养瓶中，分组同实验1。各组细胞培养72h后，Western blot 步骤按文献2 进行。实验重复3次。显影结果经SynGene凝胶成像系统进行灰度分析。数据采用SPSS 统计软件进行配对t检验。3.MTT检测反义ODN对T24药物敏感性的影响：T24细胞按5×104/孔接种于96孔板, 37培 养12h。每组设3个复孔，分五组：(1)T24空白对照组；(2)正义 ODN组（

12、10mol/L）；(3) 丝裂霉素（MMC，日本Tokyo公司产品）组，根据我室前期实验结果，终浓度为0.2mol/L， 以MMC预处理2h后更换无MMC培养液继续培养；(4)硫代反义ODN（10mol/L）联合MMC组，T2 4细胞经反义ODN预处理24h，再加入MMC（浓度同上）预处理2h后更换无MMC 培养液继续培养；(5)自稳定反义ODN（10mol/L）联合MMC组，处理同第4组。MTT实 验按文献1进行。实验结果采用SPSS统计软件进行student's检验。4. 流式细胞仪分析细胞凋亡：实验分组及各组间处理情况同实验3。流式细胞仪分析按文献4进行，统计学处理 采用2检验。

13、 结果一、自稳定反义ODN稳定性测定于20血清温育0、1、2、4、6、12、24h后，变性聚丙烯酰胺电泳显示自稳定反义ODN在各 时相点均为完整形式，而硫代反义ODN在4h后基本降解。二、反义ODN对IGF1R基因表达的影响T24空白对照组IGF1R mRNA相对表达量为 1.37±0.17，经硫代反义ODN作用后IGF1R mRNA 相对表达量为 0.37±0.07, 较T24空白对照组下降74(P0.001)；经自稳定反义O DN作用后IGF1R mRNA相对表达量为0.22±0.13,较T24空白对照组下降84.3%（P<0.001） 。而正义ODN组

14、IGF1R mRNA相对表达量为1.29±0.27，与T24空白对照组相比差异无显著性 (P0.05)。三、反义ODN对IGF1R蛋白表达的影响(1)     1反义ODN对T24细胞IGF1R蛋白表达的影响1、2：T24空 白对照组；3、4：硫代反义ODN组；5、6；自稳定反义ODN组；7、8：K562阳性对照组 灰度分析结果表明，T24空白对照组灰度值为 1614±156，经硫代反义ODN处理后，灰度值 为621±27，IGF1R蛋白表达量下降61.3%(P0.01)，经自稳定反义ODN处理后，灰度 值为276±

15、;186，IGF1R蛋白表达量下降77.0%(P0.01)。四、反义ODN对T24膀胱癌细胞药物敏感性的影响MTT检测不同浓度IGF1R反义ODN对T24膀胱癌细胞药物敏感性的影响(A560值)见表1。T24空白 对照组、正义ODN组及0.2mol/L MMC处理组间差异无显 著性(P0.05)，经10mol/L硫代反义ODN及5mol/L、10mol/L自稳定ODN处理后， T24膀胱癌细胞对MMC的药物敏感性显著增强，与T24空白对照组相比P均0.01，与M MC组相比，P均0.05。表1不同浓度IGF1R 反义ODN对T24膀胱癌细胞药物敏感性的影响(A560值)组别5mol/L10mo

16、l/LT24空白对照组1.17±0.191.17±0.19正义ODN组1.08±0.181.15±0.16MMC组0.95±0.280.92±0.15硫代反义ODN+MMC组0.46±0.010.32±0.04自稳定反义ODN+MMC组0.31±0.050.25±0.03     五、流式细胞仪分析结果经反义ODN及反义ODN联合MMC处理后，在G1期前可检测到有特征性的亚二倍体DNA 峰，即凋亡峰。各组细胞凋亡率：T24空白对照组为(3.9±3

17、.59)%,MMC组为(12±4.8)%, 硫代反义ODN（10mol/L）组为(25.8±2.08)%, 硫代反义ODN（10mol/L）联合MMC 组为(57.2±2.8)%,自稳定反义ODN（10mol/L）组为24.9%, 自稳定反义ODN（10mol/L） 联合MMC组为(59.6±1.2)%。反义ODN组（包括硫代及自稳定反义ODN）与T24空白对照组 、 反义ODN联合MMC组与T24空白对照组、反义ODN联合MMC组与MMC组之间分别比较差异均有显著 性（P均<0.05）。 讨论ODN通过序列特异性抑制靶基因表达，成为可在基因水平调

18、控的分子信息药物。作为第一代 反义核酸硫代反义ODN已应用于临床，但其存在因非特异性而导致的副作用，呈剂量依 赖性，此与硫代ODN骨架的多阴离子特性有关5。近年来，根据天然反义RNA 构象设计的3'端带有发卡环结构的自稳定反义ODN在体内的作用效果明显优于硫代 反义ODN，具有应用前景6。反义ODN治疗膀胱肿瘤的优势为可以局部集中用药，相对组织呈特异性分布。本实验结果显 示自稳定反义ODN在血清中的稳定性明显优于3'端硫代修饰的寡核苷 酸，提示其可能为一种有效的修饰方法。反义ODN作用机理为：(1)抑制转录，反义ODN与DN A结合局部形成三链结构，干扰转录因子结合；(2)抑制

19、mRNA从细胞核向细胞质的运输，抑制 mRNA的拼接；(3)激活RNA酶H，降解mRNA；(4)和靶mRNA互补结合抑制翻译过程等2 。IGF1R基因的自稳定反义ODN可有效降低T24细胞IGF1R基因及蛋白表达，增 强肿瘤细胞对膀胱灌注药物的敏感性及凋亡易感性，为其在临床的应用提供了可行性依据。 IGF1R作为自分泌环路中的重要信号传递通路，在肿瘤增殖、凋亡、侵袭转移等方面 具有重要意义，膀胱肿瘤可高度表达IGF1R，而正常膀胱粘膜组织则表达量很低4 。研究发现，IGF系统与抗凋亡基因P53、bcl家族联系密切，IGF系统可调节p53、bcl家族基 因表达7，阻断IGF1R信号传递通路后，膀

20、胱肿瘤细胞凋亡的易感 性增强，其机制有待深入研究。作者单位：孙宏志(200080 上海市第一人民医院泌尿外科研究室)凡杰(200080 上海市第一人民医院泌尿外科研究室)唐孝达(200080 上海市第一人民医院泌尿外科研究室)参考文献1，Baserga R. The IGF-1 receptor in cell growth, transformation an d apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta ,1997，1332105-126.2，Resnicoff M,Coppola D, Sell C，et al. Growth inhibition of human melanoma cel ls in nude mice by antisense strategies to the type 1 insulin-like growth facto r receptor. Cancer Res,1994，544848-4850.3，Otu AS,Bell RS, Ohash