试论mTOR和eIF4E蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义

1、试论mTOR和eIF4E蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义 【摘要】目的 研究真核翻译启动因子eIF4E(eukaryotic initiation factor 4E)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin , mTOR)在结直肠癌中的表达和其对应的临床病理之间相互关系，寻找在大肠癌的发生、进展过程中eIF4E及mTOR的作用；研究两者之间的有无关系。方法 外科手术中获取大肠癌组织及癌旁组织各60例（要求手术患者在手术前未进行全身化疗、放疗及其他治疗），采用逆转录酶聚合酶链反应技术及酶联免疫法检测大肠癌组织及癌旁组织中mTOR和eIF4E

2、基因的RNA水平和蛋白水平表达变化。结果 1、分别用RT-PCR法和酶联免疫法检测结果显示：大肠癌组织中mTOR和eIF4E基因的表达明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P0.05)。mTOR和eIF4E基因RNA表达与性别、年龄、临床TNM分期差异无统计学意义(P0.05)，在不同肿瘤分化程度以及有无淋巴结转移上差异有统计学意义(P0.05)。 2.相关性分析显示mTOR和eIF4E在大肠癌中的表达呈显着正相关(P0.05)。结论 mTOR和eIF4E基因的过度表达在大肠癌的发生、发展中起重要作用，mTOR和eIF4E基因的表达与大肠癌的分化程度及淋巴结转移情况有相关性;联合检测两者在大

3、肠癌中的表达可能有助于恶性程度的评估与预后判断。【关键词】 大肠癌 mTOR eIF4E 职称论文大肠癌是发生于大肠部位的常见的消化道恶性肿瘤，居于消化道道肿瘤的第3位。mTOR 信号通路是细胞内重要的生存信号转导通路,该通路的激活与肿瘤细胞的增殖、分化、逃避凋亡、耐药及血管生成密切相关1。 哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin , mTOR)和真核细胞翻译起始因子(eukaryotic initiation factor 4E)是mTOR 信号通路中的两个重要的分子2，3。本实验拟观察试图通过收集大肠癌及癌旁组织中对mTOR 信号通路的mTOR、eI

4、F4E两个基因的检测，更进一步完善对大肠癌组织的早期诊断和预后判断提供一个新的思路。1对象与方法1.1 研究对象收集2010年l0月至2012年6月来自乌海市第三人民医院的结肠癌根治术后癌及癌旁标本各60例其中男28例、女32例，年龄2280岁，按全国结直肠癌协作组1986年标准进行组织学分类，其中高分化l6例，中分化26例，低分化18例，TNM分期、期分别为13、23和24例，其中淋巴结转移38例。1.2 实验方法按一步Trizol法 提取样本组织的RNA：按说明书配制20ul的RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。 1 Total RNA用量为1ug。反转录反应条件如下: 37 15 mi

5、n ， 85 5 sec 按说明书配制50ul的PCR反应液，94 30sec ，56 * 15sec ，25Cycle72 30sec 。设循环25个,实验采用GAPDH片段作为内参照。mTOR、eIF4E、GAPDH引物采用Oligo软件进行设计，由invitrogen公司合成（具体序列见表一）。取PCR产物5ul，加5xLoading Buffer 2ul，2%琼脂糖凝胶电泳 110V，100mA，25min，凝胶成像仪成像并保存结果。表1 PCR引物详细序列：1.3 按酶联免疫法（ELISA）试剂盒说明书检测mTOR,eIF4E基因蛋白表达 计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出

6、标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。1.4 统计学处理 实验数据采用表示，组间比较采用t 检验，两组以上比较采用方差分析，相关分析采用直线相关分析法分析。以SPSS13.0 统计软件进行统计学分析。P 0.05 为差异有统计学意义。2 结 果RT-PCR、Elisa法检测大肠癌及癌旁组织mTOR、eIF4E基因RNA水平的表达和蛋白表达结果一致。结果显示：大肠癌mTOR、eIF4E基因表达量结果一致，癌组织明显高于癌旁组织，差异显着有统计学意义（P005）（见图1，2，表2，4）。相对应

7、内参基因GAPDH表达无差异（见图3）。大肠癌组织中mTOR、eIF4E基因表达与年龄、性别、TNM分期无关(P0.05)，与组织分化程度、淋巴结转移有关(P0.05)（详见表3,5）。mTOR基因和eIF4E基因相关性分析：60例大肠癌标本RT-PCR法检测mTOR基因和eIF4E基因灰度值相关性分析统计处理后结果为：r=0.892，P0.05，二者呈明显正相关性。同样用Elisa法检测mTOR基因和eIF4E基因OD值相关性分析统计处理后结果为：r=0.563，P0.05，二者呈明显正相关性图-1，2，3mTOR基因 、eIF4E基因 、GAPGH内参 RT-PCR电泳图表格 2 RT-P

8、CR法大肠癌及癌旁组织mTOR和eIF4E基因总RNA表达:(n=60，)注：*P0.01 VS 癌旁组表3 eIF4E和mTOR基因RNA的表达与临床病理特征的关系注：P1为mTOR基因，P2为eIF4E基因表格 4 Elisa法检测大肠癌及癌旁组织mTOR、eIF4E基因蛋白水平的表达结果（n=60，）。.注：*P0.01 VS 癌旁组表5 eIF4E和mTOR基因蛋白的表达与临床病理特征的关系 注：P1为mTOR基因，P2为eIF4E基因 3 讨论结直肠癌是目前最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率表现为明显上升趋势。目前结直肠癌的主要根据Dukes分期或TNM 分期两种分期方法来

9、进行预后的估计，治疗方案的选择也是主要根据此分期系统进行的。多基因和多因素的共同作用可能是导致肿瘤的产生、以及进展的因素。其中各种致癌的因素和环境的因素通过协同、序贯的方法导致细胞局部可复性的DNA伤害；进一步促发原癌基因的激活、抑癌基因的灭活，以及凋亡基因、凋亡抑制基因功能的改变，引起肿瘤细胞的恶性生长。目前许多学者认为在肿瘤的发生、浸润和转移过程中发挥相当重要作用两个因素是细胞的化生和肿瘤周边微血管生成。本研究通过RT一PCR和酶联免疫法等方法，分别从RNA表达水平及蛋白表达检测大肠癌及正常组织中mTOR基因的表达，结果显示：mTOR基因RNA表达水平及蛋白表达无论是在大肠癌组织还是正常组

10、组织中表现为高度一致性，大肠癌癌组织中mTOR基因呈现出过度表达，但是在于正常大肠组织中mTOR表达微弱，与上述有关参考文献研究结果一致。mTOR基因的RNA表达水平及蛋白表达在两组中均有显着统计学意义。mTOR基因的表达量与年龄、性别、TNM分期无关(P0.05)，与组织分化程度、淋巴结转移有关(P0.05)。由此思考本研究可以在大肠癌的诊断及相关预后判断上提供一定的参考价值。本研究通过逆转录聚合酶链式反应和酶联免疫法两种方法分别检测RNA水平和蛋白表达水mTOR和eIF4E基因在大肠癌组织及正常组织中的表达。结果显示：mTOR和eIF4E基因在大肠癌组织中同时过度表达，呈明显正相关，与此同

11、时，mTOR和eIF4E基因在大肠癌旁组织中同时低表达或者表达缺失，同样呈明显正相关。说明mTOR的过度激活导致了eIF4E的表达上调，从而可能成为大肠癌的形成的关键原因之一。有上述结果可以大胆猜想，同时抑制mTOR和eIF4E基因的表达及其相关生物性活性极有可能成为预防和或治疗大肠癌的有效途径之一，本实验为创新大肠癌的治疗提供一个新的思路以及一点相应的生物学依据。mTOR信号通路主要通过两种信号通路调控细胞的生长和增殖：PI3K/Akt依赖型途径和PI3K/Akt非依赖型途径。被激活后的mTOR可以调节其两条处于下游的通路：核糖体S6蛋白激酶)和真核细胞始动因子4E 结合蛋白1(4EBP1)

12、。目前4EBPl 和S6K1 是最深入研究的mTOR 的底物，它们是蛋白翻译的关键调节因子。其中4EBP1 是mTOR 的第一个下游底物，是一种翻译抑制因子，它通过与翻译启动因子4E(eIF4E,eukaryotic translation initiation factor4E)的结合而抑制翻译启动抑制蛋白翻译。正常情况下，eIF4E和其抑制物4E-BPs的结合形成复合物，从而不能触发帽依赖性翻译;而激活后的mTOR使其下游引物4EBPs磷酸化后,导致eIF4E和4EBPs的分离,从而解除对翻译的抑制作用 。可能是肿瘤形成的原因之一。 4 结论mTOR和eIF4E的异常表达在大肠癌的发生、发

13、展中起重要作用，mTOR和eIF4E的表达与大肠癌的分化程度及淋巴结转移情况有关;联合检测两者在大肠癌中的表达有助于恶性程度的评估与预后判断。参考文献1 LazaLffskaratzas A，S Kathleen，Sonenberg N：Malignant transformation by an eukaryotic initiation factor subunit that binds to mRNA 5capNature 1990，345：5447Marotrigianl J，Gingras AC，Sonenberg N，Burley SK：Cocrystal structure of

14、 the messenger RNA 5capbinding protein(elF4E)bound to 7-methylGDPCell 1 997，89：95 16 1Sarbassov DD，Aii SM，Kim DH，et a1. Rictor，a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton J. Curr Biol，2004，14(14)：1296-1302Lewis JD，Iz

15、aurralde E：The role of the cap structure in RNA processing and nuclear exportEur JBiochem 1997，247：4619Wullschleger S，Loewith R，Hall M NmTOR signaling in growth and metabolismJCell，2006，124：471484Park EH, Walker SE, Zhou F, Lee JM, Rajagopal V, Lorsch JR, Hinnebusch AG.Yeast Eukaryotic Initiation Factor (eIF) 4B Enhances Complex Assembly between eIF4A and eIF4G in VivoJ.J Biol Chem.2012 Nov 26. Epub ahead of printPaez J， Sellers W R PI3KPTENAKT pathwayA critical mediator of oncogenic signalingJ.Canc