运动对糖尿病大鼠骨胳肌细胞葡萄糖运载体4的影响

1、    运动对糖尿病大鼠骨胳肌细胞葡萄糖运载体4的影响杨晓冰吴毅李益明李云霞占飞胡永善朱尚权张新堂平蓓芳 研究表明葡萄糖的跨膜转运是骨胳肌细胞利用葡萄糖的主要限速步骤。在哺乳动物中，这一过程是由细胞膜上的葡萄糖运载体(glucose transporter, GLUT)参与并通过易化扩散来完成的1。在目前已知的6种GLUT中，骨胳肌细胞中主要存在两种，即GLUT1和GLUT4，前者活性低，只在基础状态下起作用；后者活性高，是骨胳肌细胞的主要葡萄糖运载体。通过运动可提高骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量，促进肌细胞对葡萄糖的摄取和转运。但运动对糖尿病大鼠糖代谢的

2、作用机制尚未阐明。本实验运用链脲佐菌素(STZ)引起的糖尿病大鼠为实验动物模型，观察糖尿病大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量的变化，以及运动训练对糖尿病大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量的影响，探讨运动改善糖尿病糖代谢紊乱的可能机制。 一、材料和方法 1.实验动物：雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180220g)，购自上海医科大学动物部。随机分成三组，分别为糖尿病组、糖尿病运动组和正常对照组，每组6只。糖尿病动物模型制备：大鼠腹腔内注射STZ(溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH 4.2)55mg/kg。第四日开始测尿糖和血糖，尿糖在，且血糖在16.7mmol/L以上者确定为糖尿病大鼠

3、。糖尿病大鼠随机分为两组，一组为糖尿病组，另一组则为糖尿病运动组。糖尿病运动组按Ploug方法2进行游泳训练，每周游泳5天，共6周，前两周每天游泳40分钟，以后每天游泳60分钟。 附表实验前后大鼠血糖和血清胰岛素的变化(±s) 数量 体重变化 血糖(mmol/L) 血清胰岛素(mU/L) (g/d) 开始 结束 开始 结束 正常对照组 6 2.97±0.49 4.02±0.48 3.95±0.36 9.26±0.73 9.72±0.57 糖尿病组 6 1.40±0.28 19.88±2.03* 20.03±

4、;2.04* 3.91±0.25* 3.81±0.28* 糖尿病运动组 6 1.81±0.66 18.46±1.93* 14.0±3.25*# 4.03±0.26* 4.02±0.27* 注：与正常对照组比较，*P0.01；与运动前比较，#P0.01；与糖尿病比较，P0.01 最后一次游泳结束48小时后，尾静脉采血，麻醉处死。第三组为正常对照组，大鼠腹腔内注射等量的柠檬酸缓冲液。 2.大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量的测定：(1)多克隆抗体的制备：按James方法3制备GLUT4蛋白羧基端12肽的多克隆抗体。具体过程如下：用

5、Merrifield固相合成法制备GLUT4蛋白羧基端12肽，以灭活的伤寒杆菌菌壳为载体，制成免疫原，免疫兔子。每3周加强一次。ELISA法测血清抗体滴度，获满意结果后，取血清，经亲和层析纯化，透析，冷冻干燥，得到GLUT4蛋白羧基端12肽多克隆抗体干粉。(2)骨胳肌细胞膜的制备：用改良Klips方法4制备大鼠骨胳肌细胞膜。大鼠腹腔内注射3%戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉，解剖后肢股四头肌，肌肉约为10g，浸入0缓冲液A(250mmol/L Sucrose, 50mmol/L Tris, 0.2mmol/L EDTA, pH7.4)中，剪碎，匀浆，匀浆液以9000g离心10分钟(4)，保

6、留上清，沉淀加入缓冲液A如上重复匀浆和离心，共3次，上清以190000g超速离心60分钟(4)，取沉淀，加入少量缓冲液A后用玻璃匀浆器匀浆至均一，得骨胳肌细胞膜悬浊液，分装后置于-70保存待用。膜蛋白浓度用Lowery改良法测定5。(3)Western blot法检测骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量：取3组大鼠骨胳肌细胞膜50g，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS凝胶电泳，随后转移至硝酸纤维素(NC)膜上，NC膜浸于含5%脱脂奶粉的PBS中，在水浴摇床中温育60分钟(37)，然后加入多克隆抗体过夜(4)。洗涤后与HRP标记的羊抗兔IgG水浴摇床温育1小时(37)，充分洗涤后与ECL(增强化学发光剂

7、，购自英国Amersham公司)反应1分钟，即刻用Kodak底片爆光，洗片后进行扫描(岛津双波长薄层扫描仪)，定量。以正常对照组的GLUT4蛋白含量为100作为标准，计算其他两组的相对含量。 3.生化指标的检测：三组大鼠每两天监测尿糖，实验前后测尾静脉全血糖和血清胰岛素，血糖浓度用快速血糖仪(美国强生公司产品,One Touch II型)检测，血清胰岛素浓度用放免法(中国华西糖尿病科技开发研究所试剂盒)测定。 4.统计学处理：数据以x±s表示，组间差异采用t检验。 二、结果 1.实验前后大鼠血糖和血清胰岛素含量比较：糖尿病组与糖尿病运动组的血糖和血清胰岛素的比较无显著性差异，但与正常

8、对照组比较，2组的血糖显著升高(t值分别为5.74和6.65，P0.01)，而血清胰岛素降低(t值分别为7.59和5.90，P0.01)。经运动训练后，糖尿病运动组血糖较运动前降低24%(t=4.64，P0.01)，血清胰岛素无显著变化，而糖尿病组和正常对照组实验前后血糖和血清胰岛素均无改变。运动训练后，糖尿病运动组血糖较糖尿病组低30%(t=5.08,P0.01)，见附表。 2.3组大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量的比较：结果显示糖尿病大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白的含量比正常对照组下降30.7%，糖尿病运动组大鼠骨胳肌GLUT4蛋白的含量比糖尿病组升高60.8%。 三、讨论 本实验利用较小剂

9、量STZ(55mg/kg)来制备糖尿病大鼠动物模型。实验中发现，STZ糖尿病大鼠血糖显著升高，血清胰岛素下降，骨胳肌细胞的GLUT4蛋白含量较正常对照组下降30.7%。Ramlal等6的研究显示STZ大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量较正常下降37%，这可能是由于本实验采用的STZ的剂量比Ramlal采用的剂量(65mg/kg)更小的缘故。Napoli等7同样利用STZ糖尿病动物模型证实，糖尿病大鼠葡萄糖转运功能的障碍与GLUT4蛋白内在活性的降低、GLUT4蛋白含量及转位机制障碍等因素有关。 Marette等8进一步对SHR/N-CP肥胖型糖尿病大鼠的研究表明，这类大鼠早期出现高血糖高胰岛素血

10、症，骨胳肌细胞的GLUT4蛋白的含量较正常对照组大鼠减少40%，认为高血糖的毒性作用可能与之有关，而且慢性高胰岛素可能与高血糖起协同作用，导致骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量的减少，同时实验显示细胞内GLUT4 mRNA含量减少87%，说明由于GLUT4基因转录能力下降，使GLUT4蛋白合成减少，导致肌细胞摄取和利用葡萄糖的能力下降。本实验中动物模型表现为高血糖和低胰岛素血症，同样发现糖尿病大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量明显减少。Youn等9采用了钳夹技术以维持STZ大鼠血中高胰岛素和正常血糖浓度，研究STZ大鼠GLUT4蛋白水平随时间变化的过程，虽然血糖维持在正常水平，但骨胳肌GLUT4蛋白水

11、平仍下降，糖尿病大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量均减少，从而对葡萄糖的转运和摄取减少，出现胰岛素抵抗现象。GLUT4蛋白含量的减少可能与GLUT4基因转录功能的下降有关。 运动可改善外周组织对葡萄糖的摄取和利用，不同方式的运动后，正常大鼠骨胳肌GLUT4蛋白含量上升30%200%不等10-11。去神经骨胳肌收缩研究进一步证实，收缩运动是骨胳肌GLUT4基因表达的一种调节因素12。Friedman等10在对肥胖大鼠进行跑台运动训练后发现，运动训练可刺激骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量的增加，从而提高骨胳肌细胞对胰岛素的敏感性。本实验中STZ糖尿病大鼠经过6周的游泳运动后，血糖水平明显低于运动前水平，

12、同时与糖尿病组大鼠相比，血糖水平明显降低，而血清胰岛素水平无明显变化，说明运动后尽管糖尿病大鼠的血清胰岛素仍处于较低的水平，但机体外周组织(主要是骨胳肌细胞)对葡萄糖的摄取和利用却明显增加，致血糖较运动前降低。通过对3组大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量的测定表明，糖尿病运动组大鼠骨胳肌细胞GLUT4蛋白含量明显高于糖尿病组大鼠，GLUT4蛋白含量的增加可能与运动训练促进糖尿病大鼠骨胳肌细胞GLUT4基因表达的增加有关。提示运动训练可以提高糖尿病大鼠骨胳肌GLUT4蛋白的含量，GLUT4蛋白含量的增加可能是外周组织摄取和利用葡萄糖增加的主要原因之一。另外运动训练改善了糖尿病机体外周组织对胰岛素的

13、敏感性，促进机体对葡萄糖利用，从而使血糖明显下降。 本课题为国家自然科学基金资助项目 3940012 作者单位：200040 上海华山医院康复医学科(杨晓冰、吴毅、李云霞、占飞、胡永善)，糖尿病研究室(李益明)；中科院上海生化所(朱尚权、张新堂、平蓓芳) 参考文献 1Fink P, Wallace P, Brechtel G, et al. Evidence that glucose transport is rate limiting for in vivo glucose uptake. Metabolism, 1992,41:897-902. 2Ploug T, Stallknecht

14、BN, Pedersen D, et al. Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose tranporter expression in rat skeletal muscle. Am J Physiol, 1990,259:E778-E786. 3James D, Strube M, Mueckler M, et al. Molecular cloning and characterization of an insulin-regulatable glucose transporter. N

15、ature, 1989,338:83_87. 4Klip A, Ramlal T, Young AJ, et al. Insulin-induced translocation of glucose transporters in rat hindlimb muscles. FEBS Lett, 1987,244:224_230. 5Lowery OH, Rosebrough HJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the folinphenol reagent. J Biol Chem, 1951,193:265_275. 6Ramlal T

16、, Rastogi S, Vranic M, et al. Decrease in glucose transporter number in skeletal muscle of mildly diabetic (streptozotocin-treated) rats. Endocrinology, 1989,125(2):890_897. 7Napoli R, Hirshman MF, Horton ES. Mechanisms and time course of impaired skeletal muscle glucose transport activity in strept

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