TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤(精)

1、TUNEL 细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL 法细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是；细胞内源性核酸内切酶的激活而导 致核染色质 DNA 双链的断裂。大量 DNA 片段暴露出的 3 羟基在末断转移酶 （terminaldeoxynucleotidyl transferase, TdT 或 DNA 多聚酶的作用下，与生物素或地 高辛标记的核苷酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。TUNEL 细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供试剂 1:酶浓缩溶液（Enzyme Solution试剂 2:标记溶液（Labl

2、e Solution试剂 3:转化剂-POD （Co nverter-POD酶标记抗荧光素抗体（即用型试验所需其它试剂：非石蜡切片：冲洗缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS阻断溶液:0.3%H2O2 甲醇溶液固定溶液:4%多聚甲醛（溶剂 pH7.4 新鲜配制的 PBS 溶液渗透液:0.1%Triton 甔-100（溶于新鲜配制的 0.1%枸橼酸钠溶液Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚 名:曲拉通 X-100,乳化剂 OP分子式:C34H62O11石蜡切片：二甲苯和乙醇（100%、95%、90%、80%、70%用蒸馏水稀释冲洗缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS蛋白酶 K 工作液 1020mg/ml

3、溶于 10mM Tris/HCI（pH7.47.8根据需要选择：渗透液：0.1%TritonX-100（溶于新鲜配制的 0.1%枸橼酸钠溶液胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于 HCI , pH2 或胰酶0.1M 枸橼酸缓冲液，pH6，微波修复材料:微波炉，微波输出功率 850W-2000W2 .选用中性甲醇固定的活检及实验动 物标本，常规脱水,二甲苯透明，石蜡包埋。操作步骤抗原微波修复（供参考1. 组织经福尔马林固定后会产生广泛的蛋白质交连，因此石蜡组织进行凋亡检 测时要进行预处理。经我公司科研人员的长期研究认为：TUNEL 染色时蛋白酶 K 的作用有可能引起 内源性核酸内切酶的释放，造成假阳

4、性反应，同时过量的蛋白酶 K 处理可破坏组织的 结构,用微波技术替代上述处理可避免上述弊端的出现。2.微波已被愈来愈多地作为免疫组织化学和原位杂交的预处理过程，经一定温度的微波处理可修复因 固定和包埋造成的抗原破坏，打断氨基酸的肽键结合，促进抗原决定簇的暴露，恢复细胞膜的空间结构，增加穿透效应，加速组织处理及染色过 程。我们在作 TUNEL 染色前进行微波修复，可以达到蛋白酶 K 的功效，取得较为理 想的效果，背景染色很浅，凋亡细胞阳性颗粒与背景染色对比非常鲜明。3.蛋白酶 K 作用的条件严格，消化度常因组织的不同而在操作中不便掌握。同时蛋白酶 K 的价格昂贵，而微波已作为一种常用仪器用于免疫

5、组织化学染色中。(1 切片常规脱蜡入水(2将一烧杯盛 200ml 的 0.01 M、 pH6.0 的柠檬酸缓冲液，加热至 90 95C,迅速 放入切片，使用 680W(80%功率、微波照射 1min ,加入双蒸水(2025C80ml 作迅速 冷却，将玻片移至 PBS(2025C。(3PBS 洗 5min 3次。(4 加 20%正常牛血清室温 30 min。(5 将 TUNEL 反应混合液加在切片上,37C温育 90min(阴性对照片、TUNEL 混合液中不加 TDT。(6PBS 洗 5min 3次。(73%H2O2 甲醇液室温阻断 10min。(837C温育 90min。(9 加 POD 转化

6、剂,37C温育 30min。(10PBS 洗 5min 3次。(11DAB/H2O2 显色。(12 苏木素淡染，常规脱水，透明，中性树胶封固。结果:细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞，结合形态特征,可确立凋亡细胞。阴性对 照片无棕色颗粒细胞凋亡的检测技术简介（供参考一. 凋亡细胞的形态学改变细胞表面：伪足，微绒毛等消失细胞体形态：细胞皱缩，变形，体积变小细胞核:染色质浓缩，早期染色质聚集于核膜边呈新月形或环形，晚期碎裂细胞器:密集但形态及结构完整，早期内质网短暂扩张细胞膜：完好，晚期包裹细 胞器或核碎片，形成凋亡小体在组织中表现：常常以单个细胞散在发生周围组织反应：凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞，上皮

7、细胞吞噬，降解，不发生炎症反应发生条件：属于基因控制的程序性细胞死亡，多发生于器官萎缩，细胞介导的免 疫杀伤机制，小剂量毒素作用以及多种病理生理状态二. 细胞凋亡的形态学检测方法（一凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测1.制片（1 常规组织学切片，进行脱蜡和水化。（2培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎，所以应采用低速离心制片（250g,离心 5min ,并事先将载玻片用 1%BSA 处理,使细胞易于贴 附.离心后涂片,稍经空气中干燥后 迅速用 1%多聚甲醛 4C下固定 15-30min 然后 转入 80%乙醇后固定 1-2h 保存于-20E待用.2.染色方法可用多种方法进行染色

8、。(1 可采用常规的组织学染色方法,如 Giemsa 染色，HE 染色或 Mayer 苏木素染 色.(2 采用荧光染料染色,如 DAPI(4 , 6diamidi no-2-phenylindole,PI(propidium iodide 和 7-AAD(7-aminoacetinomycin D.其染色浓度为:DAPI 1-2 卩 g/ml;PI 510 卩 g/ml;7AAD 10-20 卩 g/ml 由于 PI 染料同时也与 RNA 结合,所以应将细胞先用RNA酶消化(50Kunitz单位的RNA酶，37C下作用15min 或室温 下30min 后，再进行 PI 染色。3.结果观察典型的凋亡细胞形态学改变：细胞体积缩小及变形；核浓染及丧失亚形态结构，可见核染色质呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片；在组织切片上可见巨噬细胞或 邻近的上皮细胞吞噬凋亡细胞或凋亡小体。(二凋亡细胞的电镜观察采用电镜