洛伐他汀发酵培养基配方优化及15L罐放大

1、洛伐他汀发酵培养基配方优化及15L罐放大【摘要】利用响应面方法对土曲霉生产洛伐他汀的培养基进行了优化，使用两水平因子实验对培养基中的碳、氮源组分：葡萄糖、豆粕、蛋白胨、麦精和硝酸钠对洛伐他汀效价的影响进行分析，发现主要的影响因素为葡萄糖和豆粕。通过进一步中心组合实验，考察葡萄糖和豆粕浓度对菌浓、效价、残糖浓度、单位菌体产量(YP/X)和得率(YP/S)的作用。并通过引进残糖浓度为参考，得到最优的葡萄糖和豆粕配比分别为22%和5%，结果比对照提高了17%。同时在15L发酵罐上放大，确定最适初始葡萄糖浓度为21%，效价为7.34g/L。 【关键词】 响应面设计法； 洛伐他汀； 土曲霉； 发酵 Op

2、timization of medium components for lovastatin production and scale up in 15L bioreactor Wu Bo, Chen Chang-hua and Yang Lin (State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237) ABSTRACT Response surface design method was used to optimize

3、the medium components for lovastatin produced by Aspergillus terreus. Effects of glucose, soybean meal, peptone, malt extract and NaNO3 on lovastatin productivity were evaluated using a 2-level factorial design. Among the components investigated, glucose and soybean meal played important roles in lo

4、vastatin production. A central composite design was used to review the effects of glucose and soybean meal to concentration of biomass, lovastation, and residual glucose respectively, as well as YP/X and YP/S. The optimized concentrations of glucose and soybean meal were 22% and 5% respectively, by

5、using residual glucose concentration as a reference, and the optimized medium resulted in a significant increase of lovastatin yield by 17%, as compared with the original one. It was concluded that the optimal concertration of glucose was about 21% and the lovastatin yield was 7.34g/L. KEY WORDS Res

6、ponse surface design; Lovastatin; Aspergillus terreus; Fermentation 洛伐他汀(lovastatin)是第一个经FDA批准上市的降血脂他汀类药物，由于其竞争性的抑制了体内胆固醇合成的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG)的活性，从而起到降低血液中胆固醇含量的作用。 使用土曲霉发酵法生产洛伐他汀，有作者着眼前体的影响1，本文考虑培养基中成分如碳源、氮源、无机盐和维生素等多种因素的影响。采用响应面设计法从原发酵培养基中选出对洛伐他汀合成最主要的影响因素，并考察了培养基中主要的碳、氮源对菌浓、残糖、单位菌体产量(YP/X)和得率(

7、YP/S)的影响。 1 材料与方法 1.1 菌种和培养基 (1)菌种 土曲霉(Aspergillus terreus)Top253由河南天方药业提供。 (2)种子培养基(%) 葡萄糖10，豆粕2，蛋白胨0.5，麦精0.5，氯化钠0.2，磷酸二氢钾0.05，硫酸镁0.05。 (3)发酵培养基(%)葡萄糖20，豆粕4，蛋白胨1，麦精0.5，氯化钠0.2，磷酸二氢钾0.05，硫酸镁0.05，硝酸钠0.1，豆油0.1。 1.2 培养方法 (1)种子培养 斜面挖块约1cm2于500ml的种子摇瓶中，培养基装量50ml，26培养120h，摇床转速220r/min。 (2)发酵培养 种子液按20%的接种量接

8、入发酵培养基中，26培养240h，摇床转速220r/min。 1.3 测定方法 (1)洛伐他汀含量测定方法 实验条件 高效液相色谱为Waters HPLC系统，数据处理器为Breeze Date Processor，色谱柱为Phenomenx C18柱(250mm4.6mm)，流动相为0.1%磷酸溶液乙腈(3070)，流速为1.0ml/min，检测波长238nm。以上所有试剂为分析纯或高纯。 样品预处理 吸取发酵液(包括菌体)5ml于250ml锥形瓶中，加入20ml乙酸乙酯以及玻璃珠数颗，用橡胶塞塞好，在摇床上萃取10h，取上清液约5ml，用高速离心机以10000r/min转速离心10min，

9、0.22m孔径膜过滤上清液，置进样管中分析。 数据处理 根据高效液相色谱图积分求得的峰面积S由标准曲线y=kx+b，进样体积V(l)和稀释倍数n计算洛伐他汀的含量C： C=(S-b)/(kV)n(g/L) (2)菌浓测定方法 菌浓采用离心菌体体积测定，吸取发酵液10ml于15ml离心管中，用超速离心机以3000r/min转速离心15min，取出倒掉上清液读数，菌浓单位为ml菌体/100ml发酵液。 (3)残糖的测定方法 残糖使用斐林法测定。 (4)YP/X和YP/S的计算 单位菌体产量(YP/X)=效价/菌浓(g产物/ml菌体) 得率(YP/S)=效价/初始总糖(g产物/g葡萄糖) 2 结果与

10、讨论 2.1 两水平因子设计试验及结果 根据初始培养基配方，从中选取主要的碳、氮源：葡萄糖(A)，豆粕(B)，麦精(C)，蛋白胨(D)，硝酸钠(E)5种成分，应用Design-Expert 7.0软件进行两水平因子设计，找出最显著的影响因子，实验设计和结果如Tab.1。 从Tab.2的实验结果看出，该模型的F值为86.89，说明这个模型是显著的；如果P0.05，则说明模型中该项有显著性影响，该模型中A、B、AB、BD和CE是模型的显著项。 Curvature F(曲率)值为35.10，表示响应面中有显著的弯曲(通过中心点和因子点的平均值不同测量得知)。 Lack of fit(不符合度)反映的

11、是实验数据与模型不相符的情况，它的F值为2.31，与整个模型的86.89比起来很小，表示不符合的数据相对于纯误差是不显著的，也就是说该模型比较符合实验数据。 对模型进行方差分析得到如下数据： R2=0.9858，Adj R2=0.9745，Adeq Precision=24.453 Adeq Precision测得是信号与噪音的比率，它的值通常应大于4，本实验等于24.453，说明这个模型能合适地反映实验结果。方程系数R2为0.9858表示此方程有较好的拟合度，方程与实际情况比较相符，并能做出相对准确的预测2，3。 在模型中可以看出葡萄糖(A)和豆粕(B)的浓度对洛伐他汀的效价是显著的影响因子

12、。其中葡萄糖的P值0.0001，说明葡萄糖的量对洛伐他汀的效价是最显著的因子。葡萄糖是培养基中最主要的碳源，供应菌体生长，并且产生洛伐他汀合成所必需的前体乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A4。培养基中的氮源为限制性因素，豆粕是培养基中重要的氮源，直接影响菌浓的高低，洛伐他汀是胞内产物，所以其高产量必然要求一定的菌体量，当豆粕浓度过高时，使得过多的碳源用于合成菌体，而流向洛伐他汀合成的碳源减少。 2.2 中心组合实验 根据以上两水平因子设计实验选出两个主要影响因素(葡萄糖和豆粕)，接下来的中心组合实验固定麦精、蛋白胨和硝酸钠的浓度，对葡萄糖和豆粕的浓度进行优化。前面实验设计的结果显示，洛伐他汀的效价随

13、着初始糖浓度的提高而增大，在实验设计的葡萄糖浓度范围(10%30%)内，并没有出现拐点。但是初始糖浓度太高，使得残糖浓度上升，当培养基中初始糖浓度达到30%时，发酵结束时测得的残糖浓度还有7%，这对实际生产中生产成本以及后期的提取是不利的，所以我们引进残糖浓度作为参考，调整初始糖浓度为16%24%，使得发酵结束残糖浓度适中，同时考察葡萄糖和豆粕对菌浓、效价、残糖浓度、单位菌体产量(YP/X)和得率(YP/S)的影响。实验方案和结果见Tab.3、Tab.4。用Design-Expert 7.0软件对数据进行分析，得到葡萄糖和豆粕浓度对菌浓影响的三维模拟图(Fig.1)，其中A为葡萄糖，B为豆粕，

14、Fig.1表明对菌浓的影响是一个线性的模型，并由软件得到菌浓的模拟公式： 菌浓(%)=20.0+0.130A+5.20B 从以上公式看出培养基中豆粕的含量对菌浓的高、低是最主要的影响因素。当葡萄糖浓度为20%时，将培养基中豆粕浓度由3%提高到5%，则菌浓由38%增加到49%。由于培养基中氮源是限制性因素，随着豆粕的增加，菌浓增大。葡萄糖的量增加也会影响菌浓，当豆粕浓度为4%时，葡萄糖浓度从16%提高到24%，菌浓从43%增加到44%，可见葡萄糖浓度对菌浓影响不显著。 用Design-Expert 7.0软件对数据进行分析，得到葡萄糖和豆粕浓度对洛伐他汀效价影响的三维模拟(Fig.2)，Fig.

15、2表明葡萄糖和豆粕相对于效价的影响是一个线性模型，葡萄糖的量对洛伐他汀的效价是最显著的影响因素，随着葡萄糖的增量，洛伐他汀的效价也增长，培养基中豆粕浓度为4%时，葡萄糖由16%增加到24%，效价从5.00g/L提高到6.78g/L，与Casas等5报道的初始碳氮比高更有利于洛伐他汀的合成是一致的。效价的模拟公式： 效价(g/L)=1.21+0.22A+0.051B Fig.1 The effect of A and B to biomass concentration Fig.2 The effect of A and B to lovastatin concentration 葡萄糖主要用于

16、菌体合成，维持菌体的代谢以及洛伐他汀和一些副产物的合成。洛伐他汀的生物合成起始于乙酰辅酶A单位，丙二酸单酰辅酶A作为延伸单位，在由lovB基因编码的洛伐他汀九酮体合成酶(LNKS)的催化下形成一个六氢萘环九酮体，经过一系列反应形成monacolin L，最后接入一个由洛伐他汀二酮体合成酶(LDKS)催化形成的2-甲基丁酸侧链。在这过程中甲基由S-腺苷甲硫氨酸提供6，所以乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A的量直接决定洛伐他汀的产量，而它们主要通过葡萄糖代谢产生。豆粕的量增加同样可以提高洛伐他汀的产量，但是效果不明显。 葡萄糖和豆粕的量共同决定残糖的浓度，并且它们有交互作用，其响应面如Fig.3。利用软

17、件分析得到残糖的模拟公式： 残糖浓度(%)=7.35-0.76A-0.38B- 0.08AB+0.03A2+0.22B2 Fig.3 The effect of A and B to residual glucose concentration 残糖随初始糖浓度下降而降低，当豆粕为4%，初始糖浓度为24%时，残糖为1.4%；当初始糖浓度下降到17%左右时，残糖基本上耗尽；当初始糖浓度为24%时，培养基被氮源限制。残糖随培养基中豆粕量减少而增加，实验中当豆粕浓度从5%减少到3%，残糖浓度从1.07%提高到2.07%。豆粕浓度的增加使菌浓增大，更多的葡萄糖用于菌体合成，残糖浓度降低。当初始糖浓度为

18、16%时，葡萄糖和豆粕浓度对残糖产生交互影响，豆粕对残糖的影响为波谷型，在豆粕为4%左右残糖最低。 同样对单位菌体产量来说(Fig.4)，随着初始葡萄糖浓度的上升，单位菌体产量也上升，豆粕为4%时，随葡萄糖浓度从16%增加到24%，YP/X从0.0114g/g提高到0.0150g/g。说明对单位菌体来说，更多的葡萄糖可以用于合成洛伐他汀，但是当葡萄糖达到一定浓度后，增速趋于平稳，说明这时候前体的供应已经不是洛伐他汀合成过程中的限制性因素。豆粕浓度增加使更多的葡萄糖用于合成菌体，用于洛伐他汀合成的碳源减少，同时提高了菌体量，单位菌体能够利用的葡萄糖量也减少了，进一步制约了用来合成洛伐他汀的碳源，

19、导致YP/X下降。葡萄糖和豆粕对YP/X存在交互作用，最高的YP/X为0.0159g/g，出现在葡萄糖24%，豆粕3%时。 Fig.4 The effect of A and B 收率受葡萄糖浓度的影响最大(Fig.5)，它随葡萄糖浓度上升而减小，当豆粕浓度为4%，葡萄糖浓度从16%增加到24%，YP/S由0.0309g/g减少到0.0283g/g。由于葡萄糖是快速利用碳源，高浓度的葡萄糖下，菌体更容易产生一些副产物。 Fig.5 The effect of A and B to YP/S 实验中以效价最大为目标，并且设定残糖浓度低于0.5%，通过软件的优化，得到最优的葡萄糖和豆粕浓度分别为2

20、2%和5%。对照效价为7.02g/L，优化后效价为8.21g/L，比对照提高了17%，并且残糖控制在0.5%以内。 2.3 15L发酵罐放大实验 在15L罐(FUS-15，二档六单叶搅拌浆)上分别以初始糖浓度18%、21%和24%进行发酵。 从效价上看，初始糖浓度分别以18%、21%和24%进行发酵时， 得到的洛伐他汀的产量分别为5.65、7.34和5.56g/L(Fig.6)。当初始糖浓度为18%时，残糖在210h为1.1%，基本耗尽，这时效价达到最高；当初始糖浓度提高到21%时，前期洛伐他汀的效价增速平稳，168h后增长速度加快，发酵到202h，残糖只有1.3%，这时效价停止增长，达到7.

21、34g/L。 初始糖浓度为24%时，洛伐他汀效价增长一直比较缓慢，发酵结束256h残糖还有4.3%(Fig.7)。同时通过对菌形的观察，发现初始糖浓度为24%时，菌体多为丝状，而正常多为球状。主要是由于在高糖浓度下，发酵液粘稠，阻碍了氧的传递。土曲霉是好氧菌，Lai等7报道，维持较高的溶氧是洛伐他汀高产的重要因素，在5L的发酵罐上，维持溶氧在20%的水平，洛伐他汀的产量比对照提高了38%。同时最有利于洛伐他汀合成的菌形是密实的球状菌。为了提高溶氧，就要提高搅拌转速，搅拌桨对菌体的剪切力加大，使部分菌球被打散，同时被打散的菌丝在发酵液中起到了一个播种的效果，在高搅拌转速下，新生长的菌丝不能结球，

22、这样进一步加大了发酵液的黏度8，溶氧只能维持在一个比较低的水平，最终导致洛伐他汀的产量降低。 1: 24%; 2: 21%; 3: 18% Fig.6 Time course of lovastatin production at different original glucose concentrations 1: 24%; 2: 21%; 3: 18% Fig.7 Time course of glucose comsuption at different original glucose concentrations 通过15L罐的放大实验，发现初始糖浓度太低，葡萄糖较早耗尽，洛伐他汀

23、合成由于缺乏碳源而停止；初始糖浓度太高，阻碍发酵液中的氧传递，使得溶氧较低，同时对土曲霉的菌形产生影响，形成丝状菌，阻碍洛伐他汀的合成，并且初始糖浓度较高导致残糖浓度过高，对生产成本不利。最终得出初始糖浓度为21%时比较适合。【参考文献】 1 张育杰，胡海峰，朱宝泉. 前体对洛伐他汀生物合成的影响J. 中国抗生素杂志，2006，3(9)：5292 江元翔，高淑红，陈长华. 响应面设计法优化腺苷发酵培养基J. 华东理工大学学报(自然科学版)，2005，31(3)：3093 李啸，陈长华，李友元. 红霉素A发酵条件的优化J. 中国医药工业杂志，2006，37(6)：3814 Richard C, Kennedy H J, Park C, et al. Aspects of the biosynthesis of non-aromatic fung