浅论Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

1、浅论Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响 作者：宋萍 郑金旭 管淑红, 邵启祥 李坚【摘要】 目的： 探讨Livin基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法： 用阳离子脂质体介导Livin ASODN转染至A549细胞，反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Livin基因 mRNA的表达;MTT法检测转染细胞的生长抑制情况。结果： 转染ASODN后A549细胞的Livin 基因mRNA的表达明显减少，Livin 基因ASODN显着抑制A549细胞增殖，并呈剂量依赖性，与对照的错义寡核苷酸(

2、missense oligodeoxynucleotides,MSODN)比较差异有统计学意义(P0.05)。结论： Livin反义寡核苷酸能明显抑制A549细胞Livin基因 mRNA的表达，抑制细胞增殖，Livin基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。 【关键词】 肺癌; 反义寡核苷酸;LivinAbstract Objective: To explore the effects antisense oligodeoxynucleotides(ASODN)of Livin mRNA on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 c

3、ells. Methods: Livin ASODN was transfected into A549 cells mediated by lipofectamine 2000. The expressions of Livin mRNA was detected by RTPCR. The proliferation rates of A549 cells were assessed by the MTT assay. Results: It was observed that the expressions of Livin mRNA in ASODN group were decrea

4、sed in a concentration dependent manner. The cell growth inhibition was evidently increased in the ASODN transfected cells.The difference was significant compared with cells in Livin missense oligodeoxynucleotides (MSODN)(P0.05). Conclusion: Livin ASODN significantly down regulated the expression of

5、 Livin mRNA and increased growth inhibition in A549 cells. Therefore Livin gene may become a new molecular target for gene therapy for lung cancer.Key words lung cancer; antisense oligodeoxynucleotides; Livin肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，由于肺癌早期无典型特异症状 , 初诊时大多数患者已属于局部晚期或发生远处转移，全身化疗是此类患者治疗的主要手段，但是肺癌尤其是非小细胞肺癌的化疗效果多

6、不理想，靶向治疗为提高肺癌疗效提供了的一条颇具希望的新途径。Livin是凋亡抑制蛋白家族中的一个重要成员，在多数恶性肿瘤组织中表达增高。本研究旨在通过Livin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)转染A549细胞，观察对肺腺癌细胞A549增殖的影响，探讨Livin作为肺癌新靶点治疗的可能性。1 材料与方法1.1 主要试剂DMEM培养基(Gibco公司);小牛血清(甘肃兰州民海生物科技有限公司);噻唑蓝，二甲亚砜(Amresco公司);LipofectamineTM 2000，Trizol(Invitrogen 公司);ReverAid试剂

7、盒(Mbi公司);Ex Taq酶为TaKaRa公司产品;人肺癌细胞A549由江苏大学生命科学院提供。1.2 方 法1.2.1 细胞培养 A549细胞选用含10%小牛血清的DMEM培养液中，置于37，5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。1.2.2 寡核苷酸的设计与合成 ASODN及错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotides,MSODN)序列参照文献1，由上海生工生物工程有限公司合成，并对寡核苷酸进行硫代磷酸化修饰，以提高其血清稳定性。反义序列为5ACCATCACCGGCTGCCCAGT3; 错义序列为5GTCAGGATCTTCCCACGGAG3。1.2.3

8、细胞转染及分组 当细胞进入对数生长期后，0.25%胰酶消化接种,待细胞贴壁融合达70%，换成无血清培养基。按照LipofectamineTM2000试剂说明书将脂质体分别与ASODN和MSODN在无血清培养基中混合，制成脂质体寡核苷酸复合物(LipASODN和LipMSODN)。根据处理A549细胞的方式不同分为6组：加入LipASODN终浓度为200 nmol/L的A200组，终浓度为400 nmol/L的A400组，终浓度为600 nmol/L的A600组;加入LipMSODN终浓度为200 nmol/L的M200组;只加入脂质体的Lip对照组;同时设未加任何处理的空白对照组。细胞转染6

9、h后更换含血清培养基，继续培养48 h。1.2.4 RTPCR 检测Livin mRNA表达 于转染后48 h收集各组细胞，用Trizol提取总RNA，经紫外分光光度仪检测总RNA浓度后，用ReverAid试剂盒获得cDNA。参考Livin基因序列设计引物，上游引物序列:5CTGAGGAGTTGCGTCTGGC3,下游引物序列：5GCACGGCACAAAGACGAT3,扩增片段长度为545 bp。另设计看家基因GAPDH作为内参照，上游引物序列为：5GGATTTGGTCGTATTGGG3，下游引物序列为：5GGAAGATGGTGATGGGATT3，扩增片段长度为205 bp。所有引物均由上海生

10、工生物工程有限公司合成。PCR扩增条件：94变性5 min，95 30 s,55退火30 s,延伸 72 30 s，36个循环。PCR产物经2%琼脂糖电泳鉴定。目的基因Livin mRNA的相对表达量以Livin/GAPDH灰度比值表示。1.2.5 MTT法检测A549细胞转染后的生长抑制率 当细胞进入对数生长期后，0.25%胰酶消化，用培养基调整其浓度为1105/ml,每次取100 l接种于96孔板，当细胞贴壁融合达70%时转染。转染48 h后每孔加入5 mg/ml MTT 20 l孵育培养4 h，弃去上清液，每孔分别加入二甲亚砜(DMSO)150 l，室温下震荡15 min,用酶标仪测定4

11、90 nm处光密度值。每组设5个复孔，计算细胞的生存率(%)=(实验组D值/对照组D值)100%。1.3 统计学处理应用SPSS 10.0统计软件进行方差分析，P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 转染后A549细胞Livin mRNA表达的变化转染A549细胞48 h后收集细胞，采用RTPCR方法检测Livin mRNA表达， LipASODN几个浓度组的Livin mRNA相对表达量低于M200组(1.680.07)、Lip对照组(1.650.08)及空白对照组(1.700.08)(P0.05)。并且随LipASODN终浓度的增高，Livin mRNA相对表达量减少(A200组为

12、1.430.06，A400组为0.990.04，A600组为0.570.05)。见图1。2.2 MTT法检测ASODN对A549细胞增殖抑制的影响不同浓度Livin ASODN处理A549细胞，MTT法检测分析显示A549细胞生存率均下降，细胞增殖受到抑制，呈剂量依赖性，而Lip对照组和M200组细胞生存率下降不明显，细胞增殖无明显抑制(表1)。表1 Livin ASODN对A549细胞增殖的影响 3 讨 论大部分肺癌患者发现时已是肿瘤晚期，化疗是肺癌综合性治疗的重要手段之一，但常因肿瘤细胞的耐药而导致化疗失败,寻求肿瘤特异靶点进行靶向治疗是目前肿瘤研究的热点之一。近年来研究发现细胞凋亡相关基

13、因异常表达，不仅与肿瘤的发生、发展有关，而且在肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药中发挥了重要作用，凋亡负性调控基因的过度表达致使肿瘤抗凋亡能力增强,而导致肿瘤细胞的耐药。凋亡抑制蛋白家族是独立于Bcl2的一类抗凋亡蛋白。Livin是2000年发现的凋亡抑制蛋白家族中的新成员，基因定位于染色体20q13.3，全长4.6 kb，包含7个外显子及6个内含子，因剪接方式的不同有两种异构体Livin 和 Livin ，有研究认为它们在功能上没有本质差别。Livin特有的BIR 结构域与Caspases蛋白家族中的多个成员相互作用发挥抗凋亡的作用。已有研究显示 Livin 在膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、肝癌

14、等多数肿瘤中有特异性的高表达，而在正常组织中不表达或低表达5-9，这就可能为肿瘤基因治疗提供了靶点。近来研究发现，Livin与化疗耐受有关。Wang等10在对结肠癌HCT8/V 细胞研究中发现, 高表达Livin的 HCT8/V细胞对多种化疗药产生耐受，减少Livin表达可促进细胞凋亡，提高HCT8/V细胞对多种化疗药物的敏感性。ASODN是一种人工合成的单链片段，通过碱基互补原则能与特定的DNA或RNA结合，阻止基因转录与翻译，从而特异地阻断目的基因的表达，而不影响其他基因的正常功能。寡核苷酸经硫代磷酸修饰后可提高耐受核酸水解的能力及转染效率。ASODN技术由于能选择性抑制基因表达具有广阔的

15、应用前景。本研究以A549细胞为研究对象，以全硫代磷酸化修饰Livin ASODN，同时合成MSODN作为对照来证明ASODN抑制作用的特异性，采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染细胞，结果显示肺腺癌A549细胞经ASODN转染后，Livin基因mRNA的表达明显减少，而MSODN的Livin mRNA表达无明显变化。随着ASODN浓度的增高，对Livin mRNA 的阻断作用逐渐增强，细胞增殖受到抑制的程度也随之增高，而MSODN转染组对细胞增殖无明显抑制作用,可能机制为ASODN封闭Livin基因mRNA的表达，抑制了细胞增殖。总之，我们的研究结果表明，Livin反义

16、寡核苷酸可抑制肺癌细胞Livin基因表达，并通过此途径抑制肺癌细胞增殖，Livin有可能成为肺癌基因治疗的新靶点，ASODN治疗肺癌可能是一种颇有希望的肿瘤治疗新方法。【参考文献】 1 刘 川,吴小候,张唯力,等. Livin反义寡核苷酸诱导人肾癌细胞凋亡及其机制的研究J.第三军医大学学报, 2008,30(17): 1622-1625. Lopes RB,Gangeswaran R,McNeish IA,et al.Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is im

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