抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞

1、抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用 作者：安政雯1,2；刘宏伟1,3；贾志敏4；李照峰1；Staffan Str觟mblad2；张宏权2(南方医科大学1南方医院口腔科，4药学院，广东 广州510515；2Karolinska Institute Department of Biosciences and Nutrition, Sweden Huddinge SE-141 57；3同济大学附属口腔医学院，上海  200072)摘要：目的  克隆PAK5-N 端基因并诱导其表达，进行多克隆抗体制备，为研究其在牙胚细胞中

2、的生物学功能奠定基础。方法  根据人全长PAK5 cDNA序列，设计引物；利用PCR技术，以PAK5 全长cDNA为模板扩增PAK5-N端基因，将扩增产物克隆至pGEX-4T-1载体中，经EcoRI /XhoI 双酶切后进行重组质粒鉴定，DNA测序。以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌BL21中表达。利用GST融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化，通过免疫家兔制备多克隆抗体，并在牙胚细胞中进行了初步研究。结果和结论  成功克隆了PAK5-N端基因，在E.coli中表达了PAK5-NT，并纯化了GST融合蛋白，制备了PAK5特异性抗体。Western blotting

3、表明PAK5 在牙胚细胞中过度表达，为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据。关键词：PAK5；基因克隆；蛋白表达；多克隆抗体；牙胚细胞中图分类号：R392.4  文献标识码：A  文章编号：1673-4254(2006)06-0730-04Preparation of anti-P21-activated kinase 5 polyclonal antibody and its application in dental germ cellsAN Zheng-wen1,2； LIU Hong-wei1,3； JIA Zhi-min4； LI Zhao

4、-feng1； Staffan Str觟mblad2； ZHANG Hong-quan2Department of Stomatology, Nanfang Hospital1, College of Pharmacy4, Southern Medical University, Guangzhou 510515，China; 2Karolinska Institute Department of Biosciences and Nutrition, Huddinge SE-141 57, Sweden; 3Affiliated Dental School of Tongji Universi

5、ty, Shanghai 200072, ChinaAbstract: Objective To clone PAK5-N terminal sequence for expression in E.coli to prepare its polyclonal antibody, and examine the role of PAK5 in dental germ cells. Methods  Based on human PAK5 cDNA sequence, PCR primers were designed to amplify PAK5-N terminal s

6、equence. The PCR product was cloned into the expression vector pGEX-4T-1 EcoRI/XhoI sites, and the recombinant plasmids were identified by agarose gel electrophoresis followed by DNA sequence analysis. The recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21 and the expression of GST-fusion protei

7、n was induced by IPTG. Glutathione-Sepharose beads were used to purify GST-fusion PAK5-N-terminal fragment. Anti-PAK5 polyclonal antibody was obtained in immunizing rabbits with purified GST-PAK5 N-terminal fusion protein, and the antibodies were purified by protein A beads and used for detection of

8、 PAK5 expression in dental germ cells. Results and Conclusions We successfully cloned PAK5-N terminal gene fragment, and achieved protein expression, purification and production of PAK5-NT polyclonal antibody. The results of Western blotting indicated that PAK5 can be highly expressed in the dental

9、germ cells, suggesting that PAK5 may play an important role in biological function of dental germ cells.Key words: PAK5-N terminal; gene cloning; protein expression; polyclonal antibodies; dental germ cells收稿日期：2005-09-12基金项目：瑞典医学会(17450)；瑞典癌症基金会(050373)Supported by Swedish Medical Society(17450) an

10、d Swedish Cancer Foundation(050373)作者简介：安政雯(1973-)，女，在读硕士研究生，主治医师，E-mail: Zhengwen.Anbiosci.ki.se通讯作者：张宏权，电话：0046-8-6089267，传真：0046-8-6081501，E-mail: Hongquan.Zhangbiosci.ki.se；刘宏伟，电话8121，传真E-mail: hongwei_dds     P21 激活的磷酸化蛋白激酶 (PAKs) 作为Rho 家族中小GTP 酶，

11、Rac 和Cdc42 下游的效应因子以及MAPK信号通路上游的调控元件，包括2个亚家族(PAKI 和PAKII)，6个家族成员(PAK1-6)12。PAKs在调节细胞生长、增殖、分化、基因调节，细胞骨架重排以及细胞调亡等过程中起到重要作用3。PAK5 是一种最近被证实而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成员之一，属于第二组PAK亚家族4。研究表明蛋白激酶在口腔细胞中参与重要的功能调节，如参与牙周膜细胞的成骨分化，牙槽骨代谢通路的调节以及在放线伴放线杆菌感染的牙周炎时参与口腔上皮细胞调亡的调控等567。本实验构建了pGEX-4T-1-PAK5-NT表达载体，转化E.coli BL21

12、受体菌，诱导其表达并制备多克隆抗体，初步鉴定了PAK5在牙胚细胞中高表达，为进一步研究PAK5在口腔细胞中的生物学作用提供了重要的研究基础。    1  材料和方法    1.1  主要仪器    PCR仪(Santa Cruz Biotechnology)；凝胶图像分析仪(Bio-RAD)；超声裂解仪(Sonic & Materials INC. USA)；高速离心机(Kendro Laboratory Products. G

13、ermany)；超高速离心机(Beckman Coulter, Inc.)；摇床(K  hner Lab-Therm, Switzerland)；Western blotting 转膜仪(Tamro med-lab, UK)。    1.2  主要试剂    DNA纯化回收试剂盒和质粒DNA小量纯化试剂盒(GENOMED GmbH, Germany)；质粒PCR-Blunt，载体质粒pGEX-4T-1，Glutathione Sepharose 4B和层析柱(Amersham

14、 Biosciences)；受体菌BL21 (Invitrogen)；DAN 电泳槽(Bio-RAD)；PVDF膜(Millipore Corporation, USA)。ECL(PerkinElmerTM)；-tublin 抗体(Lab Vision Corporation)；HRP-conj.goat anti-rabbit IgG抗体和HRP-conj.donkey anti-mouse IgG 抗体(Jakson)。    1.3  方法    1.3.1  引物&#

15、160; 根据人类cDNA文库中PAK5全基因组序列，设计扩增N端基因的引物，引物由Invitrogen合成。5'端引物：5'-CCG AAT TCA TGT TTG GGA AGA AAA AGA A-3'加EcoRI酶切位点。3'端引物：5'-ATC TCG AGT CAC GAG GCT CTC TGA TAC TCC-3' 加Xho I酶切位点。    1.3.2  PCR扩增  反应物为：Primer1, Primer2, 10×PCR

16、buffer, 25 mol/L dNTP, template, Taq polymersase, dH2O，总反应体积100 l。PCR条件：94   1 min，55   1 min，72   1 min，35个循环；72   延伸7 min。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的DNA片断。    1.3.3  pGEX-4T-1-PAK5-NT重组质粒载体的构建   将目的片断连接入pGEX-4T-1载体后转化E.

17、coli BL21细菌、氨苄青霉素平板筛选、挑选阳性克隆、小量质粒制备及EcoR I/Xho I双酶切获得目的基因，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。    1.3.4  序列分析   挑选上述阳性克隆，小量提取质粒酶切并测序。测序结果采用NCBI的BLAST 软件与数据库中已登陆的序列进行同源性分析，以验证测序结果的正确性。    1.3.5  PAK5-NT蛋白的表达、纯化及抗体制备   pGEX- 4T-1-PAK5-NT重组质粒转

18、化E.coli BL21细菌、氨苄青霉素平板筛选、挑选4个阳性克隆分别置与氨苄青霉素终浓度为50 mg/ml的LB培养基中，在37 加入IPTG进行小量诱导。 取250 l诱导产物进行SDS-PAGE胶鉴定。然后挑选出表达GST-PAK5-NT的菌株再进行大量诱导。诱导产物分别置与高速离心管中，6500 r/min离心20 min，收集离心沉淀物经液氮反复冻融，超声裂解及1%Triton X-100处理获取细胞中的蛋白，按GST融合蛋白纯化系统的方案进行蛋白纯化，SDS-PAGE胶进行产物鉴定。将纯化分离出来细胞上清全部在SDS-PAGE胶中进行蛋白分离，切胶回收GST-PAK5-NT特异性的

19、蛋白条带。再将回收胶置于透析袋，加入TAE液，4 透析过夜后，在DAN电泳槽中50 V，电泳6 h使蛋白从胶中游离出来进入透析袋的TAE中，收集浓缩含GST- PAK5-NT的TAE液至2 ml。分别取浓缩液1 l，2 l与GST标准蛋白在SDS-PAGE胶中进行蛋白定量。当蛋白含量大于1 mg/ml时，即可用于抗体制备。本实验抗体由BioGenes GmbH，Germany制备。经免疫2只家兔，20 d后第1次放血，2月后二次放血而制备出多克隆抗体。Western blotting进行抗体鉴定。    1.3.6  牙胚细胞中PAK

20、5 蛋白表达水平的鉴定   牙胚细胞裂解液由本室保存，为第3代大鼠牙胚细胞。原代细胞取自出生4 d后大鼠的下颌骨第1，2磨牙牙胚。一般认为PAK5在神经细胞中表达高，而在其他组织中表达低。本实验共取4种细胞裂解液蛋白10 g与牙胚细胞裂解液一起，利用Western bloting鉴定，抗体稀释度为11000。    2  结果    2.1 PAK5 NT基因片断的扩增    PAK5 NT基因编码序列672 bp；PCR产物用1.5%

21、琼脂糖凝胶电泳，可见在700 bp附近有一条特异性条带(图1)，与目的基因片断大小相近。     图1  PCR扩增基因片断鉴定电泳图    Fig.1 PCR amplification of the target gene fragment    M: DNA marker; Lanes 1-4: Amplified PAK5-NT    2.2  重组质粒的鉴定  

22、60; pGEX-4T-1-PAK5-NT重组质粒经EcoRI/XhoI双酶切后用1.5%琼脂糖凝胶电泳，可见两条特异性条带，大小分别约为4900和672 bp(图2)，与预期大小相符。    2.3  DNA序列分析    将上述鉴定的阳性克隆扩大培养后，提取质粒进行DNA序列分析。图3示部分N端基因片断的测序结果。经BLAST分析，与已知的PAK5-N端蛋白基因序列一致。     图2  pGEX-4T-1-PAK5-NT

23、重组质粒的构建与鉴定    Fig.2  Construction and identification of the pGEX-4T-1-PAK5-NT recombinant plasmids    M: DNA marker; Lanes 1-6: The upper bands are the expression vector pGEX-4T-1 after EcoRI/XhoI cleavage and the lower bands are the target gene frag

24、ment PAK5-NT    2.4  蛋白表达、纯化及定量    pGEX-4T-1-PAK5-NT重组质粒转化E.coli BL21细菌，经IPTG小量诱导后，产物用SDS-PAGE电泳鉴定(图4)，可见第3，5，7行出现特异性条带，表明2，3，4株克隆诱导成功。    对成功诱导的3株克隆进行大量培养后，获得PAK5-NT的蛋白表达，经GST蛋白纯化系统纯化后，产物SDS-PAGE电泳鉴定(图5)，结果显示目的蛋白在洗脱液2和3管中含量最高(第4，

25、5行)，在细胞沉淀中含量最少(第2行)。表明我们可以在细胞上清中得到可溶性的目的蛋白。    用标准GST蛋白对目的蛋白进行粗略的蛋白定量，结果表明目的蛋白含量大于1 mg/ml(图6)，因此可以用于抗体制备。     图3  PAK5-NT基因的序列分析    Fig.3 DNA sequence analysis of the PAK5-NT gene fragment    图4经IPTG小量诱导后的蛋白表达产

26、物SDS-PAGE电泳鉴定    Fig.4 Identification of protein expression by SDS-PAGE after IPTG induction    M: Protein marker; Lanes 1,3,5,7: Clones 1-4 induced by IPTG; Lanes 2,4,6,8: Clones 1-4 without IPTG induction    图5  GST-PAK5蛋白纯化产物SD

27、S-PAGE电泳鉴定    Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified GST-PAK5-NT fusion protein    M: Protein marker; Lane 1: Flowthrough; Lane 2: Pellet; Lanes 3-6: Elutes of 1-4 EP tubes    图6  蛋白定量的SDS-PAGE电泳分析    Fig.6 SDS-PA

28、GE analysis of purified PAK5-NT protein quantified by GST standard protein    Lanes 1-4: Different amount of GST standard protein as controls; Lanes 5-6: 1 and 2 l of the target protein for quantification compared with GST standard protein    2.5  PA

29、K5 在牙胚细胞中的高表达    比较PAK5在牙胚细胞与人类成纤维细胞及其他3种神经纤维瘤细胞中的表达(蛋白上样量为10 g)，Western blotting 证实PAK5在牙胚细胞中表达最高(图7)。     图7  PAK5抗体鉴定及在不同细胞系中的表达    Fig.7  Identification of PAK5 polyclone antibody and expression of PAK5 in different

30、cell lines    DGC: Dental germ cells; BJA: Human fibroblast; CRL2149,CRL2271, HTB11: Human neuroblastoma    3  讨论    P21激活的PAKs是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，可以和Rho家族中的小GTP酶，Cdc42和Rac结合，并在某些情况下被激活，调节细胞加工，例如基因转录，细胞形态、动力和调亡8。1994年第一个P21激活的磷酸化蛋白激酶，PA

31、K1，作为Rac相互作用的蛋白被证实8。随后，其他PAK家族成员相继被证实，包括两个亚家族的6个成员。这些蛋白激酶结构保守又非常相似，都含有N端的p21蛋白结合域(PBD)和C端的激酶域(KD)，只是组织分布不同。根据其保守的结构，PAK1-3组成PAK I亚家族，而PAK4-6构成了PAK II亚家族。由于PAK I亚家族还含有N端的自体抑制域(AID)，使之区别于PAK II亚家族。    由Dan等人首次提出在人类基因组中存在PAK5基因。PAK5基因全长编码序列为2160 bp，编码719个氨基酸。 随后PAK5被证实为一种新的功能性的蛋白激酶，

32、不同与PAK1-3，在结构上与PAK4类似10，属于PAKII亚家族。最近研究显示，PAK5可增加细胞粘附3，并在一些信号转导通路中发挥作用1112。PAK5在口腔细胞中的研究尚无报道。    我们期望获得PAK5的多克隆抗体，为下一步深入研究提供实验材料，所以本实验利用基因重组技术成功克隆了PAK5 N端基因。 PAK5 N端基因序列为672 bp，编码224个氨基酸。为了提高酶切效率，首先将PCR扩增产物与PCR-Blunt载体连连，然后再用EcoR I/Xho I双酶切下目的基因，从而获得有两个粘端，可以高效连接的基因片断，再将此基因片断与具有相同

33、酶切位点的表达载体pGEX-4T-1连接，琼脂糖凝胶电泳及DAN测序表明所克隆的基因正确。曾选用多种E.coli 菌株诱导蛋白表达，实验证明在BL21中表达最好，而在TB菌株中却表达很弱。在蛋白表达过程中， IPTG诱导剂加入之前，应监测细菌的D()值。当D()值在0.51之间时，细菌生长呈对数增长，此时加入IPTG，在37 诱导3 h，可以获得高表达的可溶性目的蛋白。在IPTG诱导表达时，适宜的温度很重要，低温时易得到可溶性的蛋白，但表达量可能会降低。当温度升高时，可能会增加表达量，同时也易形成不溶性的包涵体，则很难进行蛋白的纯化。本实验曾试图在室温下进行诱导，但未能成功，而在37 ，短时间

34、诱导，得到了高表达的可溶性蛋白，说明此实验条件为适宜条件。我们选用GST-融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化，可以得到高产量的GST-PAK5融合蛋白，最后通过免疫家兔获得了多克隆抗体，并初步证实PAK5在牙胚细胞中高表达，使进一步认识和研究PAK5在口腔细胞中的生物学功能成为可能。尽管目前有一种编号为#B50226的抗PAK5多克隆抗体出现，用于Western blot检测时，该抗体的使用浓度为1500倍稀释，但本实验制备的抗体，在同样条件下，使用浓度可以达到11000倍稀释，效价更高，特异性更强，而且本抗体还可以用于免疫荧光和免疫组织化学研究(结果未示)。故该抗体不仅可以用于口腔细胞的生物学研究

35、，为其他学科相关细胞的研究也提供了宝贵的实验材料。    (责任编辑：陈望忠)    参考文献：    1Hofmann C, Shepelev M, Chernoff J. The genetics of PakJ. J Cell Sci, 2004, 117(Pt 19): 4343-54.    2Pandey A, Dan I, Kristiansen TZ, et al.  Cloning and char

36、acterization of PAK5, a novel member of mammalian p21-activated kinase-II subfamily that is predominantly expressed in brainJ. Oncogene, 2002, 21(24): 3939-48.    3Faure S, Cau J, de Santa Barbara P, et al. Xenopus p21-activated kinase 5 regulates blastomeres' adhesive proper

37、ties during convergent extension movementsJ. Dev Biol, 2005, 277(2): 472-92.    4Ching YP, Leong VY, Wong CM, et al. Identification of an autoinhibitory domain of p21-activated protein kinase 5J. J Biol Chem, 2003, 278(36): 33621-4.    5Kawarizadeh A, Bourauel C, Gotz W, et al. Early responses of periodontal ligament cells to mechanical stimulus in vivoJ. J Dent Res, 2005, 84(10): 902-6.    6Hagel-Brad